公开课血红蛋白的提取和分离

公开课血红蛋白的提取和分离公开课血红蛋白的提取和分离第1页血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链围绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。2、血红蛋白特点：血红蛋白是人和其它脊椎动物红细胞主要组成成份,负责血液中O2和CO2运输。公开课血红蛋白的提取和分离第2页

原理：依据蛋白质理化性质差异，如分子形状和大小、所带电荷性质和多少、溶解度和吸附性质和对其它分子亲和力等等，能够用来分离不一样蛋白质。

在本课题中，咱们将以血红蛋白为试验材抖，学习蛋白质提取和分离一些基础技术

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①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白提取中分别起到什么作用。试验专题-血红蛋白提取和分离选修一教材P64公开课血红蛋白的提取和分离第3页试验操作

哺乳动物红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。1、选材：最好选取哺乳动物红细胞样品处理2、试验步骤：①红细胞洗涤粗分离：②血红蛋白释放③分离血红蛋白溶液纯化：纯度判定透析凝胶色谱法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳教材P66公开课血红蛋白的提取和分离第4页教材P67一、样品处理去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤分离纯化。1.红细胞洗涤(1)洗涤目标：(2)洗涤过程：①采集血样(每100ml加3.0g柠檬酸钠）。②低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离效果）③吸收血浆：上层透明黄色血浆。④生理盐水洗涤：用五倍体积质量分数为0.9％氯化钠溶液洗涤。⑤低速离心：（低速短时间）迟缓搅拌10min⑥重复4、5步骤三次直至上清液中已没有黄色，表明洗涤洁净。公开课血红蛋白的提取和分离第5页2.释放血红蛋白阅读思索：释放血红蛋白过程中，在洗涤好红细胞加入了哪些物质？目标分析：①蒸馏水作用是______________________________。②加入40%体积甲苯作用是____________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞细胞膜加速红细胞破裂2.使用磁力搅拌器充分搅拌，充分搅拌目标是____________________________。教材P67公开课血红蛋白的提取和分离第6页有机溶剂：血红蛋白溶液：红细胞破碎物沉淀：离心后分层示意图脂类物质：3.分离血红蛋白③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层红色透明液体。①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以r/min速度离心10min。无色透明甲苯层白色薄层固体红色透明液体暗红色沉淀物教材P67公开课血红蛋白的提取和分离第7页二、粗提取：透析（1）过程：取1ml血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml物质量浓度为20mmol/l磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。

①透析袋：由半透膜制成，常见玻璃纸、肠衣、膀胱膜。能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。②缓冲溶液：在一定范围内能够抵制外界酸或碱对溶液PH值影响，维持PH基础不变在血红蛋白整个试验室中用缓冲液是磷酸缓冲液,利用缓冲液模拟细胞内PH环境，确保血红蛋白正常结构和功效。教材P67公开课血红蛋白的提取和分离第8页装置中，B是血红蛋白溶液，则A是

；该装置用于_________，目标是

，

磷酸缓冲液

透析（粗分离）

去除样品中分子量较小杂质公开课血红蛋白的提取和分离第9页透析-----去除样品中分子量较小杂质公开课血红蛋白的提取和分离第10页三、纯化---凝胶色谱（分配色谱法）1、凝胶：一些微小多孔球体（内含许多贯通通道，由多糖类组成如葡聚糖、琼脂糖）2、原理：依据相对分子质量大小分离蛋白质方法当不一样蛋白质经过凝胶时，（）蛋白质轻易进入凝胶内部通道，旅程（），移动速度（），而（）蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在（）移动，旅程（），移动速度（），相对分子质量不一样蛋白质所以得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快教材P64公开课血红蛋白的提取和分离第11页凝胶色谱法分离蛋白质过程动画演示

公开课血红蛋白的提取和分离第12页洗脱：从色谱柱上端不停注入缓冲液，促使蛋白质分子差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子

公开课血红蛋白的提取和分离第13页纯化（凝胶色谱）1.凝胶色谱柱制作：2.凝胶色谱柱装填：教材图5－193.样品加入和洗脱去除相对分子量较大杂质蛋白

公开课血红蛋白的提取和分离第14页1.凝胶色谱柱制作：①取长40厘米，内径1.6厘米玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管一端。公开课血红蛋白的提取和分离第15页③顶塞制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按对应位置组装成一个整体。⑤安装其它从属结构公开课血红蛋白的提取和分离第16页①凝胶选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶交联程度，膨胀程度及分离范围。

75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。2.凝胶色谱柱装填：公开课血红蛋白的提取和分离第17页

A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性迟缓倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽可能紧密，以降低凝胶颗粒之间空隙。

2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质洗脱次序，降低分离效果。③凝胶色谱柱装填方法：公开课血红蛋白的提取和分离第18页

④洗涤平衡：装填完成后，马上用缓冲液洗脱瓶，在50cm高操作压下，用300ml20mmol/l磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，不然可能有气泡混入，影响液体在柱内流动与最终生物大分子物质分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒现象。缓冲液公开课血红蛋白的提取和分离第19页缓冲液3、样品加入与洗脱①加样前

打开下端出口，使柱内凝胶面上（）迟缓下降到与（）平齐，关闭出口缓冲液凝胶面缓冲液作为洗脱液公开课血红蛋白的提取和分离第20页公开课血红蛋白的提取和分离第21页②加透析样品①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：用吸管将1ml透析液样品加到色谱柱顶端③样品渗透凝胶床：样品完全进凝胶层④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱⑤搜集：待红色蛋白质靠近色谱柱底端时，用试管搜集流出液，每5ml搜集一试管连续搜集注意：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。

3、使吸管管口沿管壁围绕移动。公开课血红蛋白的提取和分离第22页问题思索：让血红蛋白处于稳定pH范围内，维持结构和功效正常。1、在血红蛋白纯化整个过程中不停用磷酸缓冲液处理目标是什么？2、与其它蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，所以在凝胶色谱分离时能够经过观察颜色来判断什么时候应该搜集洗脱液。这使血红蛋白分离过程非常直观，大大简化了试验操作。公开课血红蛋白的提取和分离第23页

假如凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确话，能清楚地看到血红蛋白红色区带均匀、狭窄、平整，伴随洗脱液迟缓流出；假如红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果不好，这与凝胶色谱柱装填相关。3、你能观察到蛋白质分离过程中，红色区带移动吗？请描述红色区带移动情况，并据此判断分离效果？公开课血红蛋白的提取和分离第24页三、电泳---血红蛋白分离判定方法1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移过程。2.原理：

许多主要生物大分子，如多肽、核酸等都含有可解离基团，在一定PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反电极移动。

电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质差异以及分子本身形状、大小不一样，使带电分子产生不一样迁移速度，从而实现样品中各种分子分离。公开课血红蛋白的提取和分离第25页3、类型：

琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。4、测定蛋白质分子量使用方法：SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳（1）组成：

是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N′—亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂作用下聚合交联成含有三维网状结构凝胶。公开课血红蛋白的提取和分离第26页

聚丙稀酰胺凝胶电泳

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移率取决于它所带净电荷多少以及分子大小等原因。

为了消除净电荷对迁移率影响，能够在凝胶中加入SDS。（2）原理：（3）作用机理:

①SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成蛋白质复合体在SDS作用下会解聚成单条肽链，所以测定结果只是单条肽链分子量。②SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷量大大超出了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不一样种蛋白质间电荷差异，使电泳迁移率完全取决于（

）。分子大小公开课血红蛋白的提取和分离第27页公开课血红蛋白的提取和分离第28页4、测定血红蛋白方法：SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳电泳迁移率完全取决于（）。分子大小公开课血红蛋白的提取和分离第29页4、纯度判定（电泳）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

经过电泳去点位置对比，确定蛋白质纯度或相对分子质量。

即可选用一组已知纯度（或相对分子量）标准蛋白与需要判定蛋白质同时进行电泳，经过比对二者电泳区带位置，确定需要判定蛋白质纯度（或相对分子质量）公开课血红蛋白的提取和分离第30页

观察你处理血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），假如分层不显著，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白原因。

另外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净红细胞，影响后续血红蛋白提取纯度。三、试验结果分析与评价

1、你是否完成了对血液样品处理？你能描述处理后样品发生了哪些改变吗？公开课血红蛋白的提取和分离第31页三、试验结果分析与评价2、你装填凝胶色谱柱是否有气泡产生？你色谱柱装填得成功吗？你是怎样判断？

因为凝胶是一个半透明介质，所以能够在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直日光灯，检验凝胶是否装填得均匀。

另外，还能够加入大分子有色物质，比如蓝色葡聚糖—或红色葡聚糖，观察色带移动情况(假如色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。)

公开课血红蛋白的提取和分离第32页1．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其分子大小、电荷性质和数量情况如右图所表示，以下相关蛋白质分离叙述正确是()0A．将样品装入透析袋中透析