吸光光度法专题知识讲座

第七章吸光光度法

Spectrophotometry思索题

1光度分析法误差起源?2怎样设计光度分析法？3光度分析法仪器特点？吸光光度法专题知识讲座第1页7.1概述1吸光光度法特点2光吸收基本定律3比色法和吸光光度法及其仪器吸光光度法专题知识讲座第2页7.1概述1

吸光光度法特点（1）定义：吸光光度法是基于物质对光选择性吸收而建立起来分析方法，包含比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱法等。我们重点讨论可见光区吸光光度法。吸光光度法专题知识讲座第3页7.1概述（2）光基本性质

吸光光度法专题知识讲座第4页7.1概述（3）吸收光谱产生原理*吸收光谱分为：原子吸收光谱和分子吸收光谱。是因物质对不一样波长光含有选择性吸收作用而产生。*原子吸收光谱

Atomicabsorptionspectrum由原子外层电子选择性地吸收一些波长电磁波而引发，为线状光谱。线状光谱-Linespectrum吸光光度法专题知识讲座第5页7.1概述*分子吸收光谱-带状光谱

molecularabsorptionspectrum

→由电子能级跃迁而产生吸收光谱[能量差在1~20(eV)]，是紫外及可见分光光度法。

UV/VisSpectrophotometry→由分子振动能级(能量差约0.05~leV)和转动能级(能量差小于0.05eV)跃迁而产生吸收光谱，为红外吸收光谱。用于分子结构研究。

InfraredSpectrophotometry→带状光谱Bandspectrum吸光光度法专题知识讲座第6页7.1概述吸光光度法专题知识讲座第7页7.1概述*单色光（monochromaticlight）：具同一波长光。*复合光（multiplexlight）：由不一样波长组成光。*紫外光（ultravioletlight）：波长200~400nm。*可见光（visiblelight）：人眼能感觉到光，波长在400~750nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定百分比混合而成*波段（waveband）：各种色光波长范围不一样。*互补色光（complementarycolorlight）：按一定百分比混合，得到白光（whitelight）。*物质颜色是因物质对不一样波长光含有选择性吸收作用而产生。吸光光度法专题知识讲座第8页7.1概述吸光光度法专题知识讲座第9页7.1概述*吸收光谱曲线或光吸收曲线（absorptioncurve）：以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。*最大吸收波长（maximumabsorptionwavelengh）：光吸收程度最大处波长，用λmax表示*吸光度（absorbance）

在可见光，KMnO4溶液对波长525nm附近绿色光吸收最强，而对紫色和红色吸收很弱。λmax=525nm。浓度不一样时，光吸收曲线形状相同，λmax不变，吸光度不一样。吸光光度法专题知识讲座第10页7.1概述（4）目视比色法(colorimetry)和吸光光度法特点

a灵敏度高。惯用于测定试样中质量分数为1%~10-5微量组分，甚至可测定低至质量分数为10-6~10-8痕量组分。b准确度较高。目视比色法相对误差为5%~10%，吸光光度法为2%~5%。c应用广泛。几乎全部无机离子和许多有机化合物都能够直接或间接地用目视比色法或吸光光度法进行测定。d仪器简单、操作简便、快速。吸光光度法专题知识讲座第11页7.1概述2光吸收基本定律(1)朗伯-比尔定律（Lambert-Beerlaw）

当一束平行单色光经过任何均匀、非散射固体、液体或气体介质时，一部分被吸收，一部分透过介质，一部分被器皿表面反射。如图6-3所表示，设人射光强度为I'0，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir。吸光光度法专题知识讲座第12页7.1概述

在吸光光度分析法中，试液和空白溶液分别置于一样质料及厚度吸收池中，然后让强度为I‘0单色光分别经过这两个吸收池，再测量其透过光强度。此时反射光强度基本上是不变，且其影响能够相互抵消。吸光光度法专题知识讲座第13页7.1概述透射比或透光度（Transmittance）

透过光强度It与人射光强度Io之比称为透射比或透光度，用T表示溶液透射比愈大，表示它对光吸收愈小;相反，透射比愈小，表示它对光吸收愈大。吸光光度法专题知识讲座第14页7.1概述朗伯(LambertJH)和比尔(BeerA)分别于1760和1852年研究了光吸收与溶液层厚度及溶液浓度定量关系，二者结合称为朗伯-比尔定律，也称为光吸收定律。

当一束强度为I0平行单色光垂直照射到长度为b液层、浓度为c溶液时，因为溶液中吸光质点(分子或离子)吸收，经过溶液后光强度减弱为I：吸光光度法专题知识讲座第15页7.1概述*朗伯-比尔定律表明：当一束单色光经过含有吸光物质溶液后，溶液吸光度与吸光物质浓度及吸收层厚度成正比。这是进行定量分析理论基础。百分比常数K与吸光物质性质、入射光波长及温度等原因相关。*含有各种吸光物质溶液，因为各吸光物质对某一波长单色光都有吸收作用，若各吸光物质吸光质点之间相互不发生化学反应，当某一波长单色光经过这么一个含有各种吸光物质溶液时，溶液总吸光度应等于各吸光物质吸光度之和。这一规律称吸光度加和性。吸光光度法专题知识讲座第16页7.1概述（2）摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度*摩尔吸收系数molarabsorptivity当浓度c用mol·L-1，液层厚度b用cm为单位表示，则K用另一符号ε来表示。ε称为摩尔吸收系数，单位为L·mol-l·m-1，它表示物质量浓度为lmol·L-1，液层厚度为lcm时溶液吸光度。吸光光度法专题知识讲座第17页7.1概述*桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数)S来表示。S是指当仪器检测极限A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来吸光物质最低含量，其单位为μg·cm-2，S与ε及吸光物质摩尔质量M关系为：吸光光度法专题知识讲座第18页7.1概述3比色法和吸光光度法及其仪器（1）目视比色法colorimetry

用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量方法。优点是仪器简单，操作简便，适宜于大批试样分析。灵敏度高，因为是在复合光-白光下进行测定，故一些显色反应不符合朗伯-比尔定律时，仍可用该法进行测定。主要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测定时暂时配制。吸光光度法专题知识讲座第19页7.1概述（2）吸光光度法Spectrophotometry

借助分光光度计来测量一系列标准溶液吸光度，绘制标准曲线，依据被测试液吸光度，从标准曲线上求得被测物质浓度或含量。Standardcurve-calibratedcurve-workingcurve吸光光度法与目视比色法在原理上不一样。吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光吸收情况，目视比色法则是比较透过光强度。比如，测KMnO4含量，吸光光度法测量是KMnO4溶液对黄绿色光吸收情况，目视比色法则是比较KMnO4溶液透过红紫色光强度。吸光光度法专题知识讲座第20页7.1概述*吸光光度法特点：入射光是纯度较高单色光，故便偏离朗伯-比尔定律情况大为降低，标准曲线直线部分范围更大，分析结果准确度较高。因可任意选取某种波长单色光，故利用吸光度加和性，同时测定溶液中两种或两种以上组分。因为入射光波长范围扩大了，许多无色物质，只要它们在紫外或红外光区域内有吸收峰，都能够测定。吸光光度法专题知识讲座第21页7.1概述(3)分光光度计及其基本部件

分光光度计按工作波长范围分类，紫外、可见分光光度计应用于无机物和有机物含量测定，红外分光光度计主要用于结构分析。分光光度计又可分为单光束和双光束两类。722型分光光度计是数字显示单光束、可见分光光度计（recordingspectrophotometer）。

旧光电比色计（photoelectriccolorimeter）

分光光度计基本部件:光源、单色器、比色皿、检测器和显示装置。吸光光度法专题知识讲座第22页7.1概述吸光光度法专题知识讲座第23页7.1概述*光源（lightsource）

用6~12V钨丝灯作可见光区光源，发出连续光谱在360~800nm范围内。光源应该稳定，即要求电源电压保持稳定。为此，通常在仪器内同时配有电源稳压器。

氢灯氘灯钨灯汞灯

hydrogendeuteriumtungstenmercurylamplamplamplamp吸光光度法专题知识讲座第24页7.1概述*单色器monochromator

单色器作用是将光源发出连续光谱分解为单色光装置。分为棱镜和光栅。棱镜（prism）：依据光折射原理而将复合光色散为不一样波长单色光，然后再让所需波长光经过一个很窄狭缝（slit）照射到吸收池上。由玻璃或石英制成。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可见光范围均可使用。吸光光度法专题知识讲座第25页7.1概述

光栅（grating）是依据光衍射和干涉原理将复合光色散为不一样波长单色光，然后再让所需波长光经过狭缝照射到吸收池上。它分辨率比棱镜大，可用波长范围也较宽。滤光片（filter）吸光光度法专题知识讲座第26页7.1概述*比色皿(coloritrough)也称吸收池。用于盛放试液容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等玻璃制成，按其厚度分为0.5cm，lcm，2cm，3cm和5cm。在可见光区测量吸光度时使用玻璃吸收池，紫外区则使用石英吸收池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，防止磨损透光面。吸光光度法专题知识讲座第27页7.1概述*检测器detector

接收从比色皿发出透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。光电管（phototube）：一个真空或充有少许惰性气体二极管。阴极是金属做成半圆筒，内侧涂有光敏物质，阳极为一金属丝。光电管依其对光敏感波长范围不一样分为红敏和紫敏两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围为625~1000nm;紫敏光电管是阴极表面涂锑和铯，适用波长范围为200~625nm。吸光光度法专题知识讲座第28页7.1概述

光电倍增管（photomultiplier）由光电管改进而成，管中有若千个称为倍增极附加电极。可使光激发电流得以放大，一个光子约产生106~107个电子。它灵敏度比光电管高200多倍。适用波长范围为160~700nm。光电倍增管在当代分光光度计中被广泛采取。

光电池photocell吸光光度法专题知识讲座第29页7.1概述*显示装置

作用是把放大信号以吸光度A或透射比T光度分析法设计方式显示或统计下来。分光光度计惯用显示装置是检流计、微安表、数字显示统计仪。吸光光度法专题知识讲座第30页

7.2光度分析法设计

1显色反应2显色条件选择3测量波长和吸光度范围选择4参比溶液选择5标准曲线制作吸光光度法专题知识讲座第31页7.2光度分析法设计1显色反应（colorreaction）待测物质本身有较深颜色，直接测定；待测物质是无色或很浅颜色，需要选适当试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用试剂称为显色剂（colorreagent）。

按显色反应类型来分，主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要。吸光光度法专题知识讲座第32页7.2光度分析法设计（1）显色反应选择A选择性好，干扰少，或干扰轻易消除;灵敏度高，有色物质ε应大于104。B有色化合物组成恒定，符合一定化学式。C有色化合物化学性质稳定，最少确保在测量过程中溶液吸光度基本恒定。这就要求有色化合物不轻易受外界环境条件影响。D有色化合物与显色剂之间颜色差异要大，即显色剂对光吸收与络合物吸收有显著区分，要求二者吸收峰波长之差Δλ(称为对比度)大于60nm。吸光光度法专题知识讲座第33页7.2光度分析法设计（2）显色剂无机显色剂不多，因为生成络合物不稳定，灵敏度和选择性也不高。如用KSCN显色测铁、钼、钨和铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒;用H2O2显色测钛等。

有机显色剂分子中含有生色团（chromophoricgroup）和助色团（auxochromegroup）。生色团是一些含不饱和键基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。这些基团中π电子被激发时需能量较小，可吸收波长200nm以上可见光而显色。助色团是含孤对电子基团，如氨基、羟基和卤代基等。这些基团与生色团上不饱和键作用，使颜色加深。吸光光度法专题知识讲座第34页7.2光度分析法设计有机显色剂A磺基水杨酸OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定螯合物，主要用于测Fe3+。B丁二酮肟NN型螯合显色剂，用于测定Ni2+。C1，10-邻二氮菲NN型螯合显色剂，测微量Fe2+。D二苯硫腙含S显色剂，萃取光度测定Cu2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+等。E偶氮胂Ⅲ(铀试剂Ⅲ)偶氮类螯合剂，强酸性溶液中测Th(Ⅳ),Zr(Ⅳ)，U(Ⅳ)等；在弱酸性溶液中测稀土金属离子。F铬天青S三苯甲烷类显色剂，测定Al3+。G结晶紫三苯甲烷类碱性染料，测定Tl3+。吸光光度法专题知识讲座第35页7.2光度分析法设计（3）多元络合物

多元络合物是由三种或三种以上组分所形成络合物。当前应用较多是由一个金属离子与两种配位体所组成三元络合物。三元络合物在吸光光度分析中应用较普遍。主要三元络合物类型。*三元混配络合物金属离子与一个络合剂形成未饱和络合物，然后与另一个络合剂结合，形成三元混合配位络合物，简称三元混配络合物。比如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形成1:1:1有色络合物，可用于钒测定，其灵敏度高，选择性好。吸光光度法专题知识讲座第36页7.2光度分析法设计*

离子缔合物金属离子先与络合剂生成络阴离子或络阳离子，再与带反电荷离子生成离子缔合物。主要用于萃取光度法。如，Ag+与1，10-邻二氮菲形成阳离子，再与溴邻苯三酚红阴离子形成深蓝色离子缔合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽剂，可测定微量Ag+。作为离子缔合物阳离子，有碱性染料、1，10-邻二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、锑)等;作为阴离子，有X-，SCN-，ClO4-，无机杂多酸和一些酸性染料等。吸光光度法专题知识讲座第37页7.2光度分析法设计

*金属离子-络合剂-表面活性剂体系

金属离子与显色剂反应时，加入一些表面活性剂，能够形成胶束化合物，它们吸收峰向长波方向移动(红移)，而测定灵敏度显著提升。当前，惯用于这类反应表面活性剂有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基苄胺、氯化十六烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、溴化羟基十二烷基三甲基铵、OP乳化剂。比如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反应，生成三元络合物，在pH8~9时呈蓝紫色，用于痕量稀土元素总量测定。吸光光度法专题知识讲座第38页7.2光度分析法设计*杂多酸

溶液在酸性条件下，过量钼酸盐与磷酸盐、硅酸盐、砷酸盐等含氧阴离子作用生成杂多酸，作为吸光光度法测定对应磷、硅、砷等元素基础。杂多酸法需要还原反应酸度范围较窄，必须严格控制反应条件。很多还原剂都可应用于杂多酸法中。氯化亚锡及一些有机还原剂，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亚硫酸盐和氢醌惯用于磷测定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷钼酸盐和磷钼酸盐还原剂。抗坏血酸也是很好还原剂。吸光光度法专题知识讲座第39页7.2光度分析法设计2显色条件选择

试验条件包含:溶液酸度，显色剂用量，试剂加入次序，显色时间，显色温度，有机络合物稳定性及共存离子干扰等。（1）溶液酸度M+HR===MR+H+*影响显色剂平衡浓度和颜色*影响被测金属离子存在状态*影响络合物组成

*pH与吸光度关系曲线确定pH范围。吸光光度法专题知识讲座第40页7.2光度分析法设计（2）显色剂用量M(被测组分)+R(显色剂)==MR(有色络合物)为使显色反应进行完全，需加入过量显色剂。但显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加人太多，反而会引发副反应，对测定不利。在实际工作中依据试验结果来确定显色剂用量。

吸光光度法专题知识讲座第41页7.2光度分析法设计（3）显色反应时间

有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快到达稳定状态，并在较长时间内保持不变;有些显色反应虽能快速完成，但有色络合物颜色很快开始褪色;有些显色反应进行迟缓，溶液颜色需经一段时间后才稳定。制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。（4）显色反应温度：显色反应大多在室温下进行。不过，有些显色反应必需加热至一定温度完成。（5）溶剂：有机溶剂降低有色化合物解离度，提升显色反应灵敏度。如在Fe(SCN)3溶液中加入丙酮颜色加深。还可能提升显色反应速率，影响有色络合物溶解度和组成等。吸光光度法专题知识讲座第42页7.2光度分析法设计（6）干扰及其消除方法

试样中存在干扰物质会影响被测组分测定。比如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，也会造成干扰。干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液吸光度。为消除以上原因引发干扰，可采取以下几个方法。吸光光度法专题知识讲座第43页7.2光度分析法设计a.控制溶液酸度b.加入掩蔽剂选取条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成络合物颜色应不干扰待测离子测定。c.利用氧化还原反应，改变干扰离子价态d.利用校正系数e.用参比溶液消除显色剂和一些共存有色离子干扰。f.选择适当波长g.当溶液中存在有消耗显色剂干扰离子时，可经过增加显色剂用量来消除干扰。h.分离以上方法均不奏效时，采取预先分离方法。吸光光度法专题知识讲座第44页7.2光度分析法设计3测量波长和吸光度范围选择（1）测量波长选择为了使测定结果有较高灵敏度，应选择被测物质最大吸收波长光作为入射光，这称为“最大吸收标准”（maximumabsorption）。选取这种波长光进行分析，不但灵敏度高，且能降低或消除由非单色光引发对朗伯-比尔定律偏离。不过，在最大吸收波优点有其它吸光物质干扰测定时，则应依据入射光波长。吸光光度法专题知识讲座第45页7.2光度分析法设计例丁二酮肟光度法测钢中镍，络合物丁二酮肟镍最大吸收波长为470nm，但试样中铁用酒石酸钠掩蔽后，在470nm处也有一定吸收，干扰镍测定。为防止铁干扰，能够选择波长520nm进行测定，即使测镍灵敏度有所降低，但酒石酸铁不干扰镍测定。吸光光度法专题知识讲座第46页7.2光度分析法设计（2）吸光度范围选择从仪器测量误差角度来看，为使测量结果得到较高准确度，普通应控制标准溶液和被测试液吸光度在0.2~0.8范围内。可经过控制溶液浓度或选择不一样厚度吸收池来到达目标。吸光光度法专题知识讲座第47页7.2光度分析法设计

4参比溶液选择利用参比溶液来调整仪器零点，可消除由吸收池壁及溶剂对入射光反射和吸收带来误差，扣除干扰影响。参比溶液选择：a试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。b显色剂为无色，被测试液中存在其它有色离子，用不加显色剂被测试液作参比溶液。c显色剂有颜色，可选择不加试样溶液试剂空白作参比溶液。吸光光度法专题知识讲座第48页7.2光度分析法设计d显色剂和试液都有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其它试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这么就能够消除显色剂和一些共存组分干扰。e改变加入试剂次序，使被测组分不发生显色反应，能够此溶液作为参比溶液消除干扰。吸光光度法专题知识讲座第49页7.2光度分析法设计5标准曲线制作

依据光吸收定律:吸光度与吸光物质含量成正比，这是光度法进行定量基础，标准曲线就是依据这一原理制作。详细方法为:在选择试验条件下分别测量一系列不一样含量标准溶液吸光度，以标准溶液中待测组分含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条经过原点直线，称为标准曲线，此时测量待测溶液吸光度，在标准曲线上就能够查到与之相对应被测物质含量。吸光光度法专题知识讲座第50页7.2光度分析法设计*有时标准曲线不经过原点。可能是因为参比溶液选择不妥，吸收池厚度不等，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清洁等原因所引发。若有色络合物解离度较大，尤其是当溶液中还有其它络合剂时，常便被测物质在低浓度时显色不完全。找出原因，加以防止。吸光光度法专题知识讲座第51页7.3光度分析法误差1对朗伯-比尔定律偏离2吸光度测量误差吸光光度法专题知识讲座第52页7.3光度分析法误差1对朗伯-比尔定律偏离

在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线情况，尤其是当吸光物质浓度较高时，显著地看到经过原点向浓度轴弯曲现象(吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引发较大误差。偏离朗伯－比尔定律原因主要是仪器或溶液实际条件与朗伯-比尔定律所要求理想条件不一致。吸光光度法专题知识讲座第53页7.3光度分析法误差（1）非单色光引发偏离*朗伯-比尔定律只适合用于单色光，但因为单色器色散能力限制和出口狭缝需要保持一定宽度，所以当前各种分光光度计得到入射光实际上都是含有某一波段复合光。因为物质对不一样波长光吸收程度不一样，因而造成对朗伯－比尔定律偏离。

吸光光度法专题知识讲座第54页7.3光度分析法误差*克服非单色光引发偏离办法◎使用比很好单色器，从而取得纯度较高“单色光”，使标准曲线有较宽线性范围。◎人射光波长选择在被测物质最大吸收处，确保测定有较高灵敏度，此处吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长光ε值大致相等，因为非单色光引发偏离要比在其它波优点小得多。◎测定时应选择适当浓度范围，使吸光度读数在标准曲线线性范围内。吸光光度法专题知识讲座第55页7.3光度分析法误差（2）介质不均匀引发偏离朗伯－比尔定律要求吸光物质溶液是均匀。假如被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光经过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射现象而损失，使透射比降低，因而实测吸光度增加，便标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。故在光度法中应防止溶液产生胶体或混浊。吸光光度法专题知识讲座第56页7.3光度分析法误差（3）因为溶液本身化学反应引发偏离溶液中吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学改变而改变其浓度，因而造成偏离朗伯—比尔定律。A解离大部分有机酸碱酸式、碱式对光有不一样吸收性质，溶液酸度不一样，酸(碱)解离程度不一样，造成酸式与碱式百分比改变，使溶液吸光度发生改变。B络合显色剂与金属离子生成是多级络合物，且各级络合物对光吸收性质不一样，比如在Fe(Ⅲ)与SCN-络合物中，Fe(SCN)3颜色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。吸光光度法专题知识讲座第57页7.3光度分析法误差

c缔合比如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成Cr2O72-，而它们对光吸收有很大不一样。在分析测定中，要控制溶液条件，使被测组分以一个形式存在，以克服化学原因所引发对朗伯－比尔定律偏离。吸光光度法专题知识讲座第58页7.3光度分析法误差2吸光度测量误差在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差主要起源。任何光度计都有一定测量误差。这些误差可能起源于光源不稳定，试验条件偶然变动，读数不准确等。

在光度计中，透射比标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引发吸光度误差也越大吸光光度法专题知识讲座第59页7.3光度分析法误差

透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺中间而不落两端。待测溶液透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.2~0.8之间，才能确保测量相对误差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量相对误差最小。

吸光光度法专题知识讲座第60页本章作业p2384，5p23911，13吸光光度法专题知识讲座第61页7.3光度分析法误差1对朗伯-比尔定律偏离2吸光度测量误差吸光光度法专题知识讲座第62页7.3光度分析法误差1对朗伯-比尔定律偏离

在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线情况，尤其是当吸光物质浓度较高时，显著地看到经过原点向浓度轴弯曲现象(吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引发较大误差。偏离朗伯－比尔定律原因主要是仪器或溶液实际条件与朗伯-比尔定律所要求理想条件不一致。吸光光度法专题知识讲座第63页7.3光度分析法误差（1）非单色光引发偏离*朗伯-比尔定律只适合用于单色光，但因为单色器色散能力限制和出口狭缝需要保持一定宽度，所以当前各种分光光度计得到入射光实际上都是含有某一波段复合光。因为物质对不一样波长光吸收程度不一样，因而造成对朗伯－比尔定律偏离。

吸光光度法专题知识讲座第64页7.3光度分析法误差*克服非单色光引发偏离办法◎使用比很好单色器，从而取得纯度较高“单色光”，使标准曲线有较宽线性范围。◎人射光波长选择在被测物质最大吸收处，确保测定有较高灵敏度，此处吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长光ε值大致相等，因为非单色光引发偏离要比在其它波优点小得多。◎测定时应选择适当浓度范围，使吸光度读数在标准曲线线性范围内。吸光光度法专题知识讲座第65页7.3光度分析法误差（2）介质不均匀引发偏离朗伯－比尔定律要求吸光物质溶液是均匀。假如被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光经过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射现象而损失，使透射比降低，因而实测吸光度增加，便标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。故在光度法中应防止溶液产生胶体或混浊。吸光光度法专题知识讲座第66页7.3光度分析法误差（3）因为溶液本身化学反应引发偏离溶液中吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学改变而改变其浓度，因而造成偏离朗伯—比尔定律。A解离大部分有机酸碱酸式、碱式对光有不一样吸收性质，溶液酸度不一样，酸(碱)解离程度不一样，造成酸式与碱式百分比改变，使溶液吸光度发生改变。B络合显色剂与金属离子生成是多级络合物，且各级络合物对光吸收性质不一样，比如在Fe(Ⅲ)与SCN-络合物中，Fe(SCN)3颜色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。吸光光度法专题知识讲座第67页7.3光度分析法误差

c缔合比如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成Cr2O72-，而它们对光吸收有很大不一样。在分析测定中，要控制溶液条件，使被测组分以一个形式存在，以克服化学原因所引发对朗伯－比尔定律偏离。吸光光度法专题知识讲座第68页7.3光度分析法误差2吸光度测量误差在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差主要起源。任何光度计都有一定测量误差。这些误差可能起源于光源不稳定，试验条件偶然变动，读数不准确等。

在光度计中，透射比标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数波动对透射比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大，读数波动所引发吸光度误差也越大吸光光度法专题知识讲座第69页7.3光度分析法误差

透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺中间而不落两端。待测溶液透射比T在15%~65%之间，或使吸光度A在0.2~0.8之间，才能确保测量相对误差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量相对误差最小。

吸光光度法专题知识讲座第70页7.4其它吸光光度法及吸光光度法应用1示差吸光光度法2双波长吸光光度法3弱酸和弱碱解离常数测定4络合物组成测定吸光光度法专题知识讲座第71页7.4其它吸光光度法及吸光光度法应用1示差吸光光度法（differential）（1）示差吸光光度法原理

吸光光度法普通仅适合用于微量组分测定，当待测定组分浓度过高或过低，会引发很大测量误差，造成准确度降低。示差吸光光度法可克服这一缺点。当前，主要有高浓度示差吸光光度法、低浓度示差吸光光度法和使用两个参比溶液精密示差吸光光度法。它们基本原理相同，且以高浓度示差吸光光度法应用最多，仅介绍高浓度示差吸光光度法。吸光光度法专题知识讲座第72页7.4其它吸光光度法及吸光光度法应用

吸光度差与这两种溶液浓度差成正比。以把空白溶液作为参比稀溶液标准曲线作为ΔA和Δc标准曲线，依据测得ΔA求出对应Δc值，从cx=co+c可求出待测试液浓度，这就是示差吸光光度法定量基本原理。吸光光度法专题知识讲座第73页7.4其它吸光光度法及吸光光度法应用（2）示差吸光光度法误差Δc(即cx－co)，测量误差为x%，结果为cx±(cx-co