免疫组化技术专家讲座

主要内容

一、荧光特征

二、荧光素

三、荧光素标识抗体方法

四、荧光抗体质量判定

五、免疫荧光组化染色方法

六、荧光显微镜

七、非特异性荧光消除方法

八、激光扫描共聚焦显微镜免疫组化技术专家讲座第1页思索题：

1.什么叫荧光？

2.惯用荧光素有哪些特征？

3.标识荧光抗体有哪二种主要制备方法？免疫组化技术专家讲座第2页4.免疫荧光组化直接法、间接法

原理和主要操作流程？

5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？

6.非特异性荧光消除方法有哪几个？免疫组化技术专家讲座第3页一、荧光特征

分子都含有电子，电子在不停地运动着。依据量子理论，运动着电子能够处于一系列不连续能量状态中，电子恪守一定规则，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴伴随与能级差相对应特定能量吸收或释放。免疫组化技术专家讲座第4页免疫组化技术专家讲座第5页激发当电子吸收能量跃迁到较高能级，

这个过程叫激发。

发射以辐身方式跃迁时，能量转化成相

应波长光，这个过程叫发射。免疫组化技术专家讲座第6页荧光跃迁到激发态电子，大多处于单重激发态。假如电子直接从单重激发态以辐身方式跃迁到基态，因为单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射连续时间也很短，这种发射光，叫荧光。免疫组化技术专家讲座第7页二、荧光素

能够产生荧光并能作为染料化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光光能并发射荧光。免疫组化技术专家讲座第8页

1、具备用于标识抗体荧光素条件

(1)应含有与蛋白质分子形成共价键化学基团，结合后不易离解，而未结合色素及其降解产物易排除。免疫组化技术专家讲座第9页(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光

素质量下降不多。

(3)标识后反抗体免疫学性质和生化

性质无影响。

(4)结合方法简便而快速，而且较稳定。免疫组化技术专家讲座第10页(5)荧光素轻易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。(6)荧光颜色与背景组织自发荧光颜色对比鲜明，能清楚判断结果。免疫组化技术专家讲座第11页2.荧光素种类

(1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量390D，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm。展现明亮黄绿色荧光，分子量389.4。免疫组化技术专家讲座第12页免疫组化技术专家讲座第13页(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是罗达明衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光。免疫组化技术专家讲座第14页免疫组化技术专家讲座第15页免疫组化技术专家讲座第16页(3)四乙基罗达明(RB200)呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长久保留。最大吸收光谱570nm，最大发射光谱596～600nm，呈明亮橙红色荧光，分子量580，RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质氨基结合。免疫组化技术专家讲座第17页免疫组化技术专家讲座第18页免疫组化技术专家讲座第19页(4)1-二甲基氨基-5-硫酰氯

(5)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）

(6)得克萨斯红（Texasred）

(7)藻红蛋白（PE）

(8)花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）免疫组化技术专家讲座第20页三、荧光素标识抗体方法

(一)FITC标识抗体方法

1.Marsshall法

(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上赖氨酸ε-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，普通最多能结合15～20个。免疫组化技术专家讲座第21页荧光素FITC-N＝C＋N-蛋白质→‖SHHFITC-N–C–N-蛋白质‖HSH免疫组化技术专家讲座第22页(2)操作流程

抗体与荧光素百分比为50-100:1

抗体准备：20mg/ml，碳酸盐缓冲液为总

量1/10。

荧光素准备：用分析天平准确称取

0.01mgFITC/1mg抗体。

结合：边搅拌边将称取荧光素加入抗体

溶液中。免疫组化技术专家讲座第23页透析

过柱Sephade×G50或G25

保留4℃-40℃等量甘油分装保留。

2.Chadwick法

3.改良法

4.透析标识法

（二）四乙基罗达明标识抗体方法

（三）藻红蛋白标识抗体方法

免疫组化技术专家讲座第24页免疫组化技术专家讲座第25页四、荧光抗体质量控制

主要进行特异性和敏感性两个方面判定。

1.特异性染色效价测定

2.非特异性染色测定

3.吸收试验

4.F/P比值测定方法免疫组化技术专家讲座第26页免疫组化技术专家讲座第27页五、免疫荧光组织化学染色方法

1.直接法简便、快速，用已知特异性标识荧光一抗与组织细胞内抗原结合。

操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。免疫组化技术专家讲座第28页(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。

(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。

(4)pH9.0缓冲甘油封片。

(5)镜检免疫组化技术专家讲座第29页免疫组化技术专家讲座第30页2.间接法是直接主要改进，先用标识已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合，随即用间接荧光标识二抗与一抗特异性结合。免疫组化技术专家讲座第31页免疫组化技术专家讲座第32页操作流程

(1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS洗3×3min。

(2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h，或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。免疫组化技术专家讲座第33页(3)荧光标识二抗适当稀释37℃30min，PBS洗3×3min。

(4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗3×3min。

(5)封片，镜检。免疫组化技术专家讲座第34页六、荧光显微镜检验方法

1.荧光显微镜荧光显微镜是免疫荧光组织化学基本工具。它是由超高压光源，滤片系统(包含激发和压制滤板)，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长光激发标本发射荧光。免疫组化技术专家讲座第35页(1)光源光源亮度应依据荧光素类型选择。小功率汞灯可满足激励普通荧光染料要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引发球内水银蒸发，经过5～15min，球内气压升至50～70标准大气压，此时到达最高亮度，成为稳定工作状态。免疫组化技术专家讲座第36页(2)滤片系统是荧光显微镜主要组成部分，是取得特定波长光，清楚荧光影像和发挥显微镜最正确性能之关键。了解滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应前提和必要条件。免疫组化技术专家讲座第37页滤片系统包含激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其它一些中性滤片。免疫组化技术专家讲座第38页荧光显微镜滤片系统激励法分光镜激发滤光片截止滤光片用途UDM400BP330-385BP360-370BA420自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNAHoechest33358,33342染色体VDM455BP400-410BA455儿茶酚胺观察BVDM455BP400-440BA475芥子喹吖因；染色体BP420-440硫磺素S：淋巴细胞吖淀黄素：核酸BDM500BP450-480BA515异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察BP470-490吖啶橙：DNA，RNABP420-480金胺结核杆菌IBDM505PB460-490BA515IFBP470-490GDM570BP510-550BA590罗丹明BP530-550四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察BP480-550碘化丙啶：DNAIGDM565BP520-550BA580IFDM600BP545-580BA610IF德克萨斯红：荧光抗体观察免疫组化技术专家讲座第39页2.标本制作要求

(1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间

(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右

(3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到上部不能充分激分。免疫组化技术专家讲座第40页(4)封片剂惯用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光亮度在pH8.5～9.5时较亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/LpH9.0～9.5碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。免疫组化技术专家讲座第41页荧光信号增强封片剂

mowiol40-884.8g

甘油12ml

蒸馏水12ml

0.2mol/LTris(pH8.5)24ml免疫组化技术专家讲座第42页上述混合（加热溶解），5000g离心，15min，最终加入1.4-diazobicydo-[2,2,2]-octane(DABcos)，终浓度2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于-20℃中。

(5)镜油免疫组化技术专家讲座第43页3.使用荧光显微镜注意事项

(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。

(2)应在暗室中进行检验。

(3)预防紫外线对眼睛损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。

(4)检验时间每次以1～2h为宜，超出90min，超高压汞灯强度逐步下降，荧光减弱。免疫组化技术专家讲座第44页(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检验，以节约时间，保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再开启光源，一天中应防止数次点燃光源。免疫组化技术专家讲座第45页(6)标本染色后应马上观察。

(7)荧光高度判断标准，分四级“－”为阴性，“＋”为仅能见明确可见荧光；“＋＋”为可见有明亮荧光；“＋＋＋”为可见刺眼荧光。免疫组化技术专家讲座第46页免疫组化技术专家讲座第47页免疫组化技术专家讲座第48页免疫组化技术专家讲座第49页免疫组化技术专家讲座第50页七、非特异性染色消除方法

依据产生原因采取适当方法，惯用方法：

1.动物脏器粉末吸收法

2.透析法

3.SephadexG-50柱层析法

4.DEAE纤维素柱层析法

5.荧光抗体稀释法

6.纯化抗原方法

7.纯化抗体方法

8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝免疫组化技术专家讲座第51页八、激光扫描共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)是80年代发展起来一项含有划时代意义高科技新产品。免疫组化技术专家讲座第52页免疫组化技术专家讲座第53页实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，从而对被检物体样品从停留到表面单层，静态平面观察进行到立体，断层扫描、动态全方面观察，在生命科学研究中得到快速应用。免疫组化技术专家讲座第54页1.仪器组成

(1)计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。

(2)激光照射系统：氩离子激光器和声光调整器。免疫组化技术专家讲座第55页

(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。(5)X－Y平台(6)Z-轴步进马达免疫组化技术专家讲座第56页2.共聚焦成像原理

激光器发出激光束经过光扩束和整形，变成一束直径较大平行光束，长通分色光镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜焦点上，样品中荧光物质在激光激发下发出沿各个方向荧光，免疫组化技术专家讲座第57页免疫组化技术专家讲座第58页一部分荧光经过物镜，长通分色反射镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜焦点外，经过焦点处针孔，由检测器接收并转变成电信号。免疫组化技术专家讲座第59页3.光信号接收和成像方式

(1)光信号接收生物样品发出荧光通常有二种接收方式：①由光电倍增管（PMT）把光信号转变成电信号；②利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。免疫组化技术专家讲座第60页(2)成像方式①载物台运动成像：以直径很小激光束照射样品，照射点发出荧光信号经PMT变成电信号，然后载物台移动到下一点，统计该点荧光强度。该方法无轴向像差，成像时间长；免疫组化技术专家讲座第61页②反射扫描成像方式，经过转动反射镜使激光连续照射样品，由CCD摄像机统计下照射点所发射荧光，成像速度快。免疫组化技术专家讲座第62页4.参数选择

基本参数：Confocal,pinhole,detector,

PMT,Stepsize,Xpoints,YPoints,scanstr,speed,LaserPwr,Autozoom,Display,BRsubval,Samples/pt等免疫组化技术专家讲座第63页5.性能特点：分辨率高，灵敏度高，扫描速度快，扫描范围大，图像存取方便，可进行光切片观察，可进行定量荧光分析。免疫组化技术专家讲座第64页6.应用

(1)组织光学切片可对活或固定细胞及组织进行无损伤系列“光学切片”，得到其各层面信息-“显微CT”。

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