程序性细胞死亡与细胞衰老

程序性细胞死亡与细胞衰老程序性细胞死亡与细胞衰老第1页机体结构细胞增殖细胞分化细胞凋亡细胞信号转导染色体（DNA与蛋白质相互作用）衰老程序性细胞死亡与细胞衰老第2页第二节细胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)●Hayflick界限(HayflickLimitation）●细胞在体内条件下衰老●衰老细胞结构改变●细胞衰老分子机理●关于人类衰老和寿命问题程序性细胞死亡与细胞衰老第3页关于人类衰老和寿命问题人类寿命有没有极限？极限是多少？抗衰老，求长寿，古往今来，人之常情，时至今日，更为大家所关注。人类寿命相关原因当代人类面临着三种衰老程序性细胞死亡与细胞衰老第4页当代人类面临着三种衰老：第一个是生理性衰老，是指伴随年纪增加所出现生理性退化，这是一切生物普遍规律。第二种是病理性衰老，即因为内在或外在原因使人体发生病理性改变，使衰老现象提前发生，这种衰老又称为早衰。第三种是心理性衰老，心理活动是生理活动更高级物质运动形式，人类因为各种原因，经常产生“未老先衰”心理状态而影响机体整体功效。

程序性细胞死亡与细胞衰老第5页程序性细胞死亡与细胞衰老第6页1遗传与人类寿命：先天性，父辈主宰。父、母享受高寿，其儿女往往也是高寿者。寿命与性别相关：人寿保险企业统计说明，♀性动物＞♂性动物，女人＞男人，为何？众说纷纭。环境与人类寿命：后天原因多样错综复杂。体魄、环境、心理、社会、营养、疾病等。其中营养及体力活动较为主要。职业与人类寿命：职业作为一个主要社会原因，对人类寿命有一定影响。日本统计，从事管理工作人员，平均寿命最长，依次为国家机关工作人员、专业技术人员、商业工作人员、农业工作人员、普通生产工人、体力劳动者、矿工。

总得说来，近20年来，细胞衰老研究取得了长足进步，但离开真正揭示细胞衰老本质，还要走很长路。一旦揭开了细胞衰老秘密，那么延缓衰老，延长寿命将成为可能，但辩证唯物主义告诉咱们，真正长生不老是不可能。研究了解细胞衰老死亡规律，目标并不是为了防止死亡，而是要延缓细胞衰老到来。

程序性细胞死亡与细胞衰老第7页研究表明：哺乳动物自然寿命为生长发育期5—7倍，借此推论，人类完成生长发育约在20~22周岁，自然寿命应是100—150岁。哺乳动物自然寿命为性成熟8—10倍。海弗里克（Hayflick）：人体细胞可进行50次左右有丝分裂，每次细胞周期为2—4年，这么推论，人寿命应在120岁左右。

程序性细胞死亡与细胞衰老第8页一、Hayflick界限(HayflickLimitation）

●概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限观点。细胞，最少是培养二倍体细胞，不是不死，而是有一定寿命；它们增殖能力不是无限，而是有一定界限，这就是Hayflick界限◆癌细胞或培养细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态 已经不一样于原先细胞◆细胞增殖能力与供体年纪相关◆物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定关系

●二倍体细胞衰老是由细胞本身决定◆决定细胞衰老原因在细胞内部，而不是外部环境◆是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老程序性细胞死亡与细胞衰老第9页物种寿命与体外培养时细胞传代次数关系Hayflick等发觉，动物体细胞在体外可传代次数，与物种寿命相关。比如，Galápagos龟最高寿命是175岁，它细胞在体外培养时能分裂100次。而小鼠寿命只有几年，所以从小鼠分离细胞在体外分裂次数不超出30次程序性细胞死亡与细胞衰老第10页细胞起源人胚肺成纤维细胞中年人肺成纤维细胞老年人肺成纤维细胞可增殖代数40-60202-4不一样年纪起源人成纤维细胞增殖代数程序性细胞死亡与细胞衰老第11页二、细胞在体内条件下衰老●在机体内，细胞衰老和死亡是常见现象，甚至在个体发育早期也会发生;●正常情况下终生保持分裂细胞，其分裂能力是否随着有机体年纪增高而下降？它们会不会衰老？◆衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期显著延长;◆衰老个体内环境原因影响了细胞增殖和衰老; ◆骨髓干细胞移植试验说明伴随年纪增加，干细胞增殖速度也趋迟缓.程序性细胞死亡与细胞衰老第12页三、衰老细胞结构改变●细胞核改变●内质网改变:衰老动物内质网成份弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网总量似乎是降低了●线粒体改变:通常，细胞中线粒体数量随龄降低，而其体积则随龄增大●致密体生成●膜系统改变

程序性细胞死亡与细胞衰老第13页细胞核改变◆体外培养二倍体细胞，细胞核伴随细胞分裂次数增加不停增大◆细胞核核膜内折（invagination）、染色质固缩化

程序性细胞死亡与细胞衰老第14页膜系统改变◆衰老细胞，其膜流动性降低、韧性减小◆衰老细胞间间隙连接

;

细胞膜内（P面）颗粒分布也发生改变

程序性细胞死亡与细胞衰老第15页四、细胞衰老分子机理●氧化性损伤学说：代谢过程中产生活性氧基团或分子（ROS---O2-，OH-

，H2O2

），引发氧化性损伤积累，最终造成衰老。●端粒与衰老：发觉端粒长度确实与衰老有着亲密关系，提出细胞衰老“有丝分裂钟”学说（Harley,1990）●rDNA与衰老:酵母染色体外rDNA环（ERC）积累，造成细胞衰老。●缄默信息调整蛋白复合物（Sircomplex）与衰老：Sircomplex存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。●SGS1基因和WRN基因与衰老：SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;

酵母sgs1突变体寿命显著短于野生型（平均9.5代:24.5代）;wrn突变引发早老症.●发育程序与衰老:●线粒体DNA与衰老:Sen-DNA(80年代)；mtDNA突变积累与细胞衰老相关. ●人类细胞衰老主导基因Ｐ16程序性细胞死亡与细胞衰老第16页

科学家发觉，癌症与“端粒酶”活性过高相关。90%恶性癌细胞里面端粒酶活性都是过高，正是这个过高端粒酶活性让癌症细胞“死不了”，无限生长，四处转移。

程序性细胞死亡与细胞衰老第17页氧化性损伤学说:该理论认为，代谢过程中产生活性氧基团或分子（reactiveoxygenspecies，ROS）引发氧化性损伤积累，最终造成衰老。ROS主要有三种类型：◆O2-，即超氧自由基；◆OH-，即羟自由基；◆H2O2。它们高度活性引发脂类、蛋白质和核酸分子氧化性损伤，从而造成细胞结构损伤乃至破坏。去除ROS，就能够延长寿命。程序性细胞死亡与细胞衰老第18页氧自由基损伤作用:1）能使质膜中不饱和脂肪酸氧化；2）使蛋白质中疏基氧化造成蛋白质交联、变性、酶钝化；3）使糖类化合物降解；4）使DNA链断裂、交联、碱基经基化、碱基切除，5）抑制蛋白质、核苷酸和脂肪酸生物合成。细制细胞内去除过多自由基机制:1）经过细胞内部本身隔离化使产生自由基物质或位点与细胞其它组分分开；2）保护性酶：主要有超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)，二者协同起保护性作用。另外还有谷胱甘肽过氧化物酶。3）其它抗氧化物分子，如维生素E和维生素C，它们都是自由基反应有效终止剂。程序性细胞死亡与细胞衰老第19页中国科学家揭开人类细胞衰老之谜(年十大科技进展之一)(年)北京大学医学部教授童坦君、张宗玉领导研究组经过多年研究，当前已初步说明人类细胞衰老主导基因Ｐ16是人类细胞衰老遗传控制程序中主要步骤，揭示了P16基因在衰老过程中高表示原因，从而初步揭开了人类细胞衰老之谜。初步说明了P16基因不但是细胞衰老遗传控制程序中主要步骤，还可影响细胞寿命与端粒（细胞生物钟）长度，它经过调整Ｒb蛋白活性，而非激活端粒酶起作用。同时发觉负调控机制减弱是细胞复制性衰老时Ｐ16基因高表示主要原因。研究人员发觉P16基因存在一个基因序列为GAAGGT负调控元件。此负调控元件相当于P16基因刹车装置。他们还发觉了掌管这一刹车装置蛋白质因子，它分子量约为24000道尔顿。深入研究显示：年轻细胞此蛋白质因子可与负调控元件结合，抑制P16基因表示，而衰老细胞缺乏此因子，所以P16基因高表示。抑制P16基因表示，不但细胞寿命延长，衰老程度减轻，而且端粒长度缩短也在减缓；反之，增强Ｐ16基因表示，不但细胞寿命缩短，衰老程度加重，而且端粒长度缩短显著加紧。程序性细胞死亡与细胞衰老第20页第一节 程序性细胞死亡

●细胞凋亡概念及其生物学意义●细胞凋亡形态学和生物化学特征●细胞凋亡分子调控机理●细胞自噬●植物细胞程序性死亡程序性细胞死亡与细胞衰老第21页植物细胞程序性死亡在形态上,多年来研究表明,植物与动物细胞PCD有许多相同特征,包含细胞形态和DNA降解改变等。当前发觉与植物程序性死亡相关因子有:caspase、CED、蛋白激酶和核酸内切酶。PCD伴伴随植物一生，在植物生长发育、形态建成及抵抗不良环境伤害中都发挥十分主要作用。大量研究结果证实,植物体各个别,如根、茎、叶、花、果等死亡,注定会在生活史特定阶段发生，这对植物体有着主要生物学意义。程序性细胞死亡与细胞衰老第22页细胞自噬（autophagy）细胞自噬是凋亡之外第二种程序性细胞死亡方式，在进化过程中高度保守，从酵母、果蝇到脊椎动物和人都能够找到参加autophagy同源基因。在形态学上，即将发生autophagy细胞胞浆中出现大量游离膜性结构，称为前自噬泡（Preautophagosome）。前自噬泡逐步发展，成为由双层膜结构形成空泡，其中包裹着变性坏死细胞器和个别细胞浆，这种双层膜被称为自噬泡（Autophagosome）。自噬泡外膜与溶酶体膜融合，内膜及其包裹物质进入溶酶体腔，被溶酶体中酶水解。依据细胞内底物运输到溶酶体腔方式不一样，哺乳动物细胞autophagy可分为三种主要方式

程序性细胞死亡与细胞衰老第23页三种主要方式：大自噬（Macroautophagy）、小自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导自噬(Chaperone-mediatedautophagy，CMA)。大自噬小自噬分子伴侣介导自噬程序性细胞死亡与细胞衰老第24页一、细胞凋亡概念及其生物学意义●细胞死亡形式●概念：细胞凋亡是一个主动由基因决定自动结束生命过程，所以也经常被称为细胞程序性死亡（programmedcelldeath,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。●生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育正常进行，自稳平衡保持以及抵抗外界各种原因干扰方面都起着非常关键作用：蝌蚪尾消失；脊椎动物神经系统发育；发育过程中手和足形成过程等。

年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在器官发育遗传调控和细胞程序性死亡方面研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。程序性细胞死亡与细胞衰老第25页细胞死亡形式细胞死亡形式分为：凋亡性程序性细胞死亡(Apoptosis)、自噬性程序性细胞死亡(Autophagy)和细胞坏死(Necrosis)三种类型。程序性细胞死亡（ProgrammedCellDeath,PCD）是有机体在漫长进化过程中发展起来细胞自杀机制，在去除无用、多出或癌变细胞，维持机体内环境稳态方面发挥主要作用。程序性细胞死亡调控机制失调与各种疾病发生发展相关，如神经变性性疾病、本身免疫病、恶性肿瘤、衰老、病原微生物感染、肌细胞功效失调等。程序性细胞死亡与细胞衰老第26页关于细胞凋亡和细胞程序性死亡在细胞凋亡一词出现之前，胚胎学家已观察到动物发育过程中存在着细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）现象，它是胚胎正常发育所必需。多年来PCD和细胞凋亡常被做为同义词使用，但二者实质上是有差异。首先，PCD是一个功效性概念，描述在一个多细胞生物体中，一些细胞死亡是个体发育中一个预定，并受到严格控制正常组成个别，而凋亡是一个形态学概念，指与细胞坏死不一样受到基因控制细胞死亡形式；其次，PCD最终止果是细胞凋亡，但细胞凋亡并非都是程序化。程序性细胞死亡与细胞衰老第27页动物机体细胞数量控制路径程序性细胞死亡与细胞衰老第28页二、细胞凋亡形态学和生物化学特征●细胞凋亡与坏死(necrosis)●细胞凋亡形态学特征●细胞凋亡生化特征●诱导细胞凋亡因子●细胞凋亡检测程序性细胞死亡与细胞衰老第29页细胞凋亡与坏死(necrosis)●二者主要区分是，细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂染色质片段或细胞器，然后逐步分离，形成众多凋亡小体（apoptoticbodies），凋亡小体则为邻近细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜整合性保持良好，死亡细胞内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包含膨大和破碎细胞器以及染色质片段，释放到胞外，造成炎症反应。●细胞凋亡与坏死比较表程序性细胞死亡与细胞衰老第30页细胞凋亡与坏死比较表坏死凋亡1.性质病理性，非特异性生理性或病理性，特异性2.诱导原因强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点被动过程，无新蛋白合成，不耗能主动过程，有新蛋白合成，耗能4.形态改变细胞结构全方面溶解、破坏、细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩5.DNA电泳弥散性降解，电泳呈均一DNA片状DNA片段化(180-200bp），电泳呈“梯”状条带6.炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应7.凋亡小体无有8.基因调控无有程序性细胞死亡与细胞衰老第31页细胞凋亡形态学特征◆凋亡起始：细胞表面特化结构如微绒毛消失，细胞间接触消失，但细胞膜依然完整；线粒体大致完整，但核糖体逐步从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐步与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布◆凋亡小体形成：核染色质断裂为大小不等片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐步形成单个凋亡小体◆凋亡小体逐步为邻近细胞吞噬并消化程序性细胞死亡与细胞衰老第32页细胞凋亡生化特征◆细胞凋亡主要特征是形成大小为

180～200bp特征性DNAladders ◆凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG

（tissueTransglutaminase）积累并达 到较高水平程序性细胞死亡与细胞衰老第33页诱导细胞凋亡因子◆物理性因子，包含射线（紫外线，

射线等），较温和温度刺激（如热激，冷激）等◆化学及生物因子：包含活性氧基团和分子，DNA

和蛋白质合成抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子

（TNF

），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等程序性细胞死亡与细胞衰老第34页细胞凋亡检测（P458）◆形态学观察：染色法、透射和扫描电镜观察◆DNA电泳：DNA片段就展现出梯状条带◆TUNEL测定法，即DNA断裂原位末端标识法◆彗星电泳法（cometassay）◆流式细胞分析依据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采取碘化丙啶使DNA激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡亚二倍体细胞，同时又能观察细胞周期状态。程序性细胞死亡与细胞衰老第35页彗星电泳法（cometassay）彗星电泳法（cometassay）原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间电泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中形成DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核展现出一个彗星式图案，而正常无DNA断裂核在泳动时保持圆球形，这是一个快速简便凋亡检测法。程序性细胞死亡与细胞衰老第36页三、细胞凋亡分子调控机理

●线虫(C.elegans)凋亡研究发觉ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 ●Caspase家族与凋亡 ●Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡程序性细胞死亡与细胞衰老第37页参加秀丽隐杆线虫细胞程序性死亡基因分组及相关作用参加秀丽隐杆线虫细胞程序性死亡15个基因，依据其作用不一样大致可分为4组。第1组含同PCD相关决定死亡两个基因，即ces-1(ces表示CE细胞存活调控基因)和ces-2基因，即该组基因在线虫CEPCD调控含有主要意义.第2组含有执行死亡四个基因：ced-3(celldeathabnormal)、ced-4、ced-9和egl-1基因。第3组含有7个与死亡细胞被吞噬细胞所吞噬基因，即ced-1、ced-2、ced-5、ced-6、ced-7、ced-10和ced-11。第四组是死亡细胞在吞噬体中被降解基因，如核酸酶基因1，即nuc-1基因，假如nuc-1发生突变，则DNA裂解受阻，但不能抑制细胞死亡，表明此核酸酶并非PCD所必需。由这四组基因共同作用造成线虫细胞程序化死亡。程序性细胞死亡与细胞衰老第38页秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis

elegans，CE)在胚胎发育期间，秀丽隐杆线虫有1090个体细胞，但在发育过程中有131个细胞死亡。所以，一个成熟秀丽隐杆线虫有959个体细胞和约1000～个性细胞。线虫成虫分雌雄同体和雄性两种性别，雌雄同体相当于雌性（上图）。虫体透明，有6对染色体，约3000个基因。程序性细胞死亡与细胞衰老第39页Caspase家族与凋亡

◆Caspase家族·Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后肽键，所以称为Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase◆Caspase活化◆有两类caspase，一类是起始者（initiators）,另一类是执行者（executioners）◆胞外信号分子诱导细胞凋亡路径程序性细胞死亡与细胞衰老第40页Caspase蛋白酶Caspase蛋白酶(cysteineasparticacidspecificprotease)是一类半胱氨基酸蛋白酶,它在动物细胞程序性死亡(PCD)中既是水解蛋白质参加者,也是细胞程序性死亡开启原因。它是动物PCD执行阶段关键酶,它活化直接造成凋亡细胞解体。程序性细胞死亡与细胞衰老第41页执行者caspase在程序性细胞死亡中作用有两类caspase，一类是起始者（initiators）,另一类是执行者（executioners）。起始caspase在外来蛋白信号作用下被切割激活，激活起始caspase对执行者caspase进行切割并使之激活，被激活执行者caspase经过对caspase靶蛋白水解，造成程序性细胞死亡程序性细胞死亡与细胞衰老第42页Caspase活化Caspase本身以非活化Procaspase存在，其激活依赖于其它Caspase在它天冬氨酸位点裂解活化或本身活化程序性细胞死亡与细胞衰老第43页胞外信号分子诱导细胞凋亡路径●凋亡信号通路当细胞接收凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内衔接蛋白(Adaptorprotein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。●下游Caspases活化后，作用底物：

﹡

裂解核纤层蛋白，造成细胞核形成凋亡小体；

﹡裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder;

﹡裂解参加细胞连接或附着骨架和其它蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；

﹡造成膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。程序性细胞死亡与细胞衰老第44页Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡◆Bcl-2是一个原癌基因，是ced-9在哺乳类中同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结