临床基因扩增检验操作规范

临床基因扩增检验操作规范临床基因扩增检验操作规范第1页一、临床基因扩增检验试验室规范化设置及其各室功效二、各阶段操作要求三、PCR污染与对策四、因操作欠规范造成问题分析临床基因扩增检验操作规范第2页一、临床基因扩增检验试验室

规范化设置及其各室功效规范化设置：要求参考《临床基因扩增检验试验室管理暂行方法》（卫医发[]10号文）附件《临床基因扩增检验试验室基础设置标准》。临床基因扩增检验操作规范第3页

1.四个隔开工作区域中每一区域都须有

专用仪器设备。2.明确标识，如加样器或试剂等。3.单一方向次序，从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区。4.使用不一样颜色或有显著区分标志工作服。5.试验室清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区方向进行。6.各自清洁用具。临床基因扩增检验操作规范第4页

各室功效：临床基因扩增检验操作规范第5页（一）试剂贮存和准备区

功效：贮存试剂制备、试剂分装和主反应混合液制备。临床基因扩增检验操作规范第6页

含反应混合液离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。戴手套。工作结束后必须马上对工作区进行清洁。试验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，普通照射过夜。试验室及其设备使用必须有日常统计。临床基因扩增检验操作规范第7页（二）标本制备区

功效：临床标本保留，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA合成。临床基因扩增检验操作规范第8页

要正确使用加样器。正压条件防止从邻近区进入本区气溶胶污染。为防止样本间交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液反应管。对含有潜在传染危险性材料，必须有明确样本处理和灭活程序。用过加样器吸头必须放入专门消毒容器内。用于RNA扩增检测样本制备好以后，应马上进行cDNA合成。

临床基因扩增检验操作规范第9页（三）扩增区

功效：DNA或cDNA扩增。临床基因扩增检验操作规范第10页

已制备DNA模板和合成cDNA加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。可降低本区气压以防止气溶胶从本区漏出。如有加样则应在超净台内进行。打开反应管前快速离心数秒。临床基因扩增检验操作规范第11页（四）扩增产物分析区

功效：扩增片段测定。临床基因扩增检验操作规范第12页

膜上微孔板上探针杂交方法、Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。本区是最主要扩增产物污染起源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意试验人员安全防护。

负压条件。临床基因扩增检验操作规范第13页二、各阶段操作要求

测定分析前标本采集处理、测定中核酸提取、扩增和产物分析以及测定后结果汇报等。临床基因扩增检验操作规范第14页（一）标本采集

临床标本包含EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。

EDTA和枸橼酸盐是首选抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶强抑制剂。

玻璃器皿在使用前应高压处理，250°烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。

临床用于RNA（如HCVRNA）扩增检测血标本应尽快（3小时以内）分离血浆，以防止RNA降解。临床基因扩增检验操作规范第15页（二）标本稳定化处理DNA：不需特殊稳定化处理。RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使DNA酶和RNA酶失活。临床基因扩增检验操作规范第16页（三）标本运输

可在常温下经过邮寄运输，如用于DNA扩增检测EDTA抗凝全血及用于RNA扩增检测GITC稳定化处理标本。未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运输。

临床基因扩增检验操作规范第17页（四）标本贮存1.血清/血浆等—-70℃2.用于DNA测定已纯化核酸样本—4℃3.用于RNA测定已纯化核酸样本—-80℃4.用乙醇沉淀核酸样本—-20℃5.GITC处理RNA标本在室温可保留7天

临床基因扩增检验操作规范第18页（五）标本处理（核酸提取）

抑制物可能起源于：标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。核酸提取过程中残留有机溶剂（如酚、氯仿等）。

痰须液化处理。

临床基因扩增检验操作规范第19页操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）注意：①离心管不能插得过低，以防进水；②水浴时不能加盖，防管盖爆开；③水浴时间须准确，10±1min；④水浴时不能走开；⑤左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。临床基因扩增检验操作规范第20页（六）靶核酸逆转录（RT）和扩增

有各种原因可引发核酸扩增检测假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg++浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导均一性极为主要。临床基因扩增检验操作规范第21页RT-PCR操作注意：①标本必须新鲜；②做RNA标本枪头离心管必须无菌；③冰上操作；④处理完后须马上上机，不能放置；⑤注意左右手分开。临床基因扩增检验操作规范第22页（七）扩增产物分析扩增产物测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。临床基因扩增检验操作规范第23页实时荧光定量PCR在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程，最终经过曲线进行定量分析。与普通荧光定量PCR使用荧光强度定量不一样，实时荧光PCR普通使用Ct（每个反应荧光信号到达设定域值所经循环数）定量，Ct与模板初始拷贝数对数成线性关系。实时荧光PCR优点：精密度高，重复性能好。临床基因扩增检验操作规范第24页TaqMan荧光定量PCR原理

探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标识，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；探针与模板杂交在引物区间内，当扩促进行时，TaqDNA聚合酶5’-3’外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；荧光信号强度与扩增产物量成正比；临床基因扩增检验操作规范第25页临床基因扩增检验操作规范第26页临床基因扩增检验操作规范第27页三、PCR污染与对策PCR污染分环境污染与反应液污染二种。常见PCR污染源有三个：第一、标本间交叉污染；第二、试验室中克隆质粒污染；第三、PCR产物污染（Carryover）。临床基因扩增检验操作规范第28页要预防PCR污染，必须做好以下3个步骤工作：（一）污染预防（二）污染源追踪（三）污染源处理临床基因扩增检验操作规范第29页（一）污染预防操作PCR时，按照下述规则可有效地预防PCR污染。1、PCR前处理及后处理要在不一样隔离工作台上或房间内进行。2、分装试剂，标识批号临床基因扩增检验操作规范第30页3、改进试验操作：

(1)带一次性手套；(2)防止反应液飞溅；(3)用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于空气，以免产物气溶胶污染；(4)操作多份样品时，要先将可混匀成份(dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准混合液(Mastermix)；(5)制备反应混合液时，最终加入样品DNA，加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧反应管。4、检验结果可重复性。临床基因扩增检验操作规范第31页（二）污染源追踪临床基因扩增检验操作规范第32页1、阳、阴性对照

选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好样品。

阴性对照选择一定要小心。

不含模板DNAPCR试剂对照。临床基因扩增检验操作规范第33页2、常见环境污染源有(1)点杂交点样器；(2)切片机；(3)离心机；(4)切胶用刀或微解剖刀；(5)浓缩用具，真空瓶；(6)电泳装置和紫外灯箱；(7)干冰/乙醇或水溶锅；(8)冰箱门把手、冷冻架和门把手。临床基因扩增检验操作规范第34页追踪可疑环境污染源①用去离子浸湿灭菌棉签擦试可疑个别②在0.1ml去离子水中浸泡；③取5μl作PCR反应；④电泳检验结果。临床基因扩增检验操作规范第35页（三）污染源处理临床基因扩增检验操作规范第36页1.环境污染处理法（1）稀酸处理法。对擦试试验阳性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡残留DNA。（2）紫外法：UV照射波长普通选择254/300nm，需考虑PCR产物长度与产物序列中碱基分布。UV对长片段（500bp以上）有效，而对短片段效果不大。临床基因扩增检验操作规范第37页2.反应液污染处理法(1)DNaseI法：PCR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5UDNaseI，室温下作用30min后，加热灭活，加入模板和Taq酶后即可进行正常PCR。

优点：廉价，不需知道扩增DNA序列。临床基因扩增检验操作规范第38页(2)内切酶法：选择识别四个碱基内切酶（如MspI等），最好几个适用，可克服其识别序列特异缺点。方法同上，只是DnaseI由内切酶（MspI10U）代替，作用时间延长到1.0～1.5h。(3)紫外照射法：反应中不加模板与Taq酶。临床基因扩增检验操作规范第39页(4)尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：dUTP代替反应中dTTP，使产物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU位置，阻止Taq酶延伸。PCR正常循环前，用UNG处理PCR反应混合液可消除PCR产物污染，而UNG在正常PCR循环变性一步就会失活，所以，对含dU新合成PCR产物没有影响。临床基因扩增检验操作规范第40页

TATATATATA

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加热

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×

PCR临床基因扩增检验操作规范第41页该法优点：①去除任河起源（包含引物在内）污染；②因为污染产物有大量dU存在，所以，UNG处理会彻底消除污染。③UNG处理与PCR扩增可在同一试管内进行。临床基因扩增检验操作规范第42页四、因操作欠规范造成问题分析临床基因扩增检验操作规范第43页（一）试验室仪器设备1、设备不齐全、不配套，使得试验结果不稳定，引发假性结果。

旋涡混合器，微量加样器，正规紫外透射仪。RNAPCR样品处理时，血清（或血浆）中加入强烈变性剂后，血样中蛋白变性、结块。吸头与微量加样器不配套。2、PCR热循环仪差异或质量问题。临床基因扩增检验操作规范第44页移液器：①禁止大力往返拧动；②禁止调至容量之外使用；③第二档为排空档，不得作吸收之用；④吸头应浸入液面2—3mm处吸收；⑤禁止将有液体移液器平放或倒置；⑥混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，重复吸收液体，将沉淀重复混匀，溶解；⑦每七天用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。临床基因扩增检验操作规范第45页离心机：①离心前，离心管须配平；②将调速档打至0档位，才能打开电源开关，逐步升高转速，直至即定转速；③定时旋钮不能强行归零；④转头未停顿时，禁止打开盖板。临床基因扩增检验操作规范第46页（二）试验室布局不合理引发污染问题1、样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片段均会经过空气进行传输。2、PCR结果检测试验室和其它试验室在一起，会出现严重扩增子污染。3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公用，也会造成严重污染。4、试验室操作垃圾（吸头、离心管、样品杯等）乱放，飘散在空气中核酸片段、病原微生物可造成试验室污染。

临床基因扩增检验操作规范第47页（三）PCR操作中存在问题分析1.阳性变阴性2.阴性变阳性3.PCR结果不稳定临床基因扩增检验操作规范第48页1.阳性变阴性

(1)有些阳性病人，经过PCR检测后为阴性，可能有两种情况：一是采集标本方法或部位不正确，二是假如病人取样部位病原体消失，需依据病人病理情况采样。临床基因扩增检验操作规范第49页(2)标本保留不妥，可引发PCR失败。搜集标本乱放（未放冰箱），病原体破裂，检测核酸降解，失去了PCR检测模板或造成标本污染。临床基因扩增检验操作规范第50页2.阴性变阳性

常见原因有以下6点：

临床基因扩增检验操作规范第51页①加入试剂或样品时引发交叉污染

（最好在加完全部其它反应成份，包含预防蒸发用矿物油后才吸加模板DNA，将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套手指轻轻单击管侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心[10秒]，使水相和有机相分开）。临床基因扩增检验操作规范第52页②加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可经过使用有滤筛吸头防止污染

（将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别反应，全部并非即用管都应盖严）。

临床基因扩增检验操作规范第53页③打开标本管盖引发样品飞溅

（打开前须瞬间离心）④操作时手套引发交叉污染

（拿过模板DNA管后应更换手套）临床基因扩增检验操作规范第54页⑤不明原因引发公用试剂如液体石蜡等污染

（必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中全部其它成份对照反应。这一对照管须在准备好全部其它PCR以后才进行吸加）。⑥试验室污染

临床基因扩增检验操作规范第55页3.PCR检测结果不稳定（1）样品处理方法不妥，标本中杂质很多，血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。蛋白质——DNA电泳带拖尾血红素中卟啉化合物——抑制Taq酶活性代谢产物——干扰引物配对

临床基因扩增检验操作规范第56页（2）操作不妥带来后果

主要指不能严格按照说明进行操作造成PCR检测失败。如HCVRNAPCR样品处理试剂A、B、C和75%乙醇操作过程。

临床基因扩增检验操作规范第57页50μl血清标本

(标本可用血清或血浆，尽可能防止使用肝素做抗凝剂，防止重复冻融)

加200μl试剂A后马上混匀

(试剂A是强烈变性剂，不但要将病毒外壳变性裂解，释放