反义核酸与rnai专题知识

反义核酸与rnai专题知识反义核酸与rnai专题知识第1页生物技术史上革命性事件核酸结构与功效揭示1PCR技术2重组DNA技术3RNAi和反义技术4反义核酸与rnai专题知识第2页概述RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发、同源mRNA高效特异性降解现象。反义核酸与rnai专题知识第3页当前对RNAi(RNAinterference)定义有很各种，不一样资料对其定义侧重点也不尽相同，假如将RNAi看作一个生物学现象，能够有以下定义：RNAi是有dsRNA参加指导，以外源和内源mRNA为降解目标转基因缄默现象。含有核苷酸序列特异性自我防御机制，是一个当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源基因发生共同基因缄默现象。反义核酸与rnai专题知识第4页假如将其作为一门生物技术，则定义为：RNAi是指体外人工合成或体内双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性将与之同源mRNA降解成21nt～23nt小片段，使对应基因缄默。RNAi是将与靶基因mRNA同源互补双链RNA(dsRNA)导入细胞,能特异性地降解该mRNA,从而产生对应功效表型缺失,属于转录后水平基因缄默(post-transcriptionalgenesilence,PTGS)。反义核酸与rnai专题知识第5页发觉过程共抑制现象发觉

RNAi研究早期线索来自于美国和荷兰两个转基因植物试验组,约根森（Jorgensen）研究小组

,在对矮牵牛(petunias)进行研究中有个奇怪发觉:他们构想将更多色素基因注入矮脚牵牛植物体中，试图加深花朵紫颜色，而结果出其预料，转基因植株不但没有新基因表示，反而使原有色素基因也受到了抑制。反义核酸与rnai专题知识第6页加入chalconesynthase基因

or转基因反义核酸与rnai专题知识第7页发觉过程Jorgensen将这种现象命名为

共抑制(cosuppression)因为导入基因和其相同内源基因同时都被抑制。

反义核酸与rnai专题知识第8页发觉过程Quelling现象

并非只有植物学家才注意到了这种意外现象。1994年意大利Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因试验中这种共抑制现象被称“quelling”（基因压制）现象。反义核酸与rnai专题知识第9页发觉过程95年康乃尔大学研究人员Guo(郭苏)和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA阻止一些基因表示，给对照组用正义RNA不但不增加该基因表示，反而产生与反义RNA一样结果——特异性阻断该基因表示，这个奇怪现象直到3年后1998才被解开。1998年Fire等发觉将dsRNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因表示，并证实了Guo和kemphues所发觉正义RNA基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成。反义核酸与rnai专题知识第10页线虫体内RNAi线虫中RNAi效应检测（左面）两条线虫表现为绿色荧光蛋白（GFP）表示类型品系，该品系含有一个普遍性表示GFP汇报基因重组质粒（带有核内定位信号位点）。（右面）喂食表示针对GFPdsRNA细菌后，整个虫体GFP信号消失。反义核酸与rnai专题知识第11页发觉过程将制备RNA高度纯化后发觉，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA基因抑制作用也很微弱，而用纯化后dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断对应基因表示。试验证实双链RNA抑制基因表示效率比纯化后反义RNA最少高几个数量，他们称此现象为dsRNA介导RNA干扰（RNAi）。

反义核酸与rnai专题知识第12页Effectsofmex-3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA.NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridizationof4-cellstageembryos.(A)Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe.(B)Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex-3RNA(purplestaining).(C)Embryofromparentinjectedwithpurified

mex-3

antisenseRNA.Theseembryos(andtheparentanimals)retainmex-3mRNA,althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype.(D)Late4-cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex-3;nomex-3RNAisdetected.(TemplatesusedforinterferingRNAandinsituprobeswerelargelynon-overlapping.)反义核酸与rnai专题知识第13页RNA干扰发觉安德鲁•菲尔(AndrewZ.Fire)、克雷格•梅洛(CraigC.Mello)

1998年发觉了RNA干扰和基因缄默现象。其论文发表在1998年NATRUE杂志上。FireA,XuS,MontgomeryMK,KostasSA,DriverSE,MelloCC.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.

Nature.1998Feb19;391(6669):806-811.反义核酸与rnai专题知识第14页发觉过程RNAi现象普遍性随即陆续发觉RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎全部真核生物中。RNAi能高效特异阻断基因表示，在线虫，果蝇体内，RNAi能到达基因敲除效果。反义核酸与rnai专题知识第15页年10月2日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣告，将年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学安德鲁·法尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发觉了RNA干扰现象。法尔和梅洛将分享一千万瑞典克朗奖金(137万美元)。

RNA干扰取得诺贝尔生理学或医学奖反义核酸与rnai专题知识第16页安德鲁•菲尔(AndrewZ.Fire)克雷格•梅洛(CraigC.Mello)麻省理工大学哈弗大学反义核酸与rnai专题知识第17页当前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很可能含有相同分子机制，都是经过dsRNA介导而特异地降解靶mRNA,抑制对应基因表示。实际上，法尔在接收诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在线虫中观察到(RNA干扰)这种尤其现象是康奈尔大学硕士郭苏。1995年，从复旦大学毕业后赴美郭苏在坎菲斯(Kenneth

Kemphues)指导下，试图阻断秀丽新小杆线虫某个基因时，意外地发觉反义和正义这两种单链RNA都阻断了该基因表示。反义核酸与rnai专题知识第18页但可惜是，他和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直到3年后，当初在卡内基研究所供职法尔和梅洛才揭开了谜底：在郭苏试验中，体外转录所得RNA污染了微量双链RNA，而经过纯化双链RNA能够高效率地阻断对应基因表示。这就是RNA干扰。郭苏当前在旧金山加州大学任职。他说：“他们在咱们工作基础上，解释了咱们那个让人迷惑现象，是一个飞跃……我和坎菲斯经过话，咱们工作在这个奖项中有所贡献，咱们为此感到自豪，也都认为安德鲁·法尔和克雷格理应获奖。”

反义核酸与rnai专题知识第19页在试验时，要认真观察每个现象，发觉怀疑并给予证实，不要被误导。反义核酸与rnai专题知识第20页正如美国西北大学神经生物学教授饶毅所说：“法尔发觉打开了一个新研究领域，它既是一项科学发觉，也是一项技术创造，为治疗人类许多疾病提供了新希望，这项成就和两位华人很相关系，其中一位就是法尔试验室研究技术员徐思群”。反义核酸与rnai专题知识第21页反义核酸与rnai专题知识第22页毕业于上海第二医科大学徐思群是那篇《自然》论文第二作者。自1992年起，从美国拿到硕士学位他在法尔试验室以研究技术员身份工作了6年。但他饰演角色不只是通常意义上负责试验室日常运作“管家”。“一个科学试验成功关键是试验设计和试验结果分析了解，这当然要归功于安迪和克雷格。我经常说我是小人，因为小人动手，君子动口和动脑，我不过是把他们试验意图比较完整地在试验台上表达出来。”徐思群说。反义核酸与rnai专题知识第23页

法尔和梅洛等人研究发表以后，激发了全球研究人员对RNA干扰领域兴趣。年和年，美国《科学》杂志连续将RNA干扰列入年度十大科学进展。反义核酸与rnai专题知识第24页

转录水平基因缄默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)转录后水平基因缄默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)TGS是指转基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而造成基因缄默。PTGS则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无对应mRNA存在这一现象。基因缄默RNA干扰分子机制基因缄默反义核酸与rnai专题知识第25页RNA干扰分子机制dsRNA产生:内源性:包含细胞内源性基因双向表示;含有反向重复序列细胞内源性基因表示产生短发夹RNA(shorthairpinRNA，shRNA)等反义核酸与rnai专题知识第26页外源性:以转基因表示mRNA为模板，经过异常聚合作用形成dsRNA;真核生物基因组中转座子在复制表示过程中产生dsRNA;RNA病毒基因组或病毒感染复制过程中产生dsRNA中间产物;采用化学合成dsRNA;或用质粒或病毒载体表示所需dsRNA等反义核酸与rnai专题知识第27页siRNA制备方法化学合成体外转录法合成siRNAsiRNA表示载体siRNA表示框架反义核酸与rnai专题知识第28页siRNA设计标准

siRNA双链设计时，普通在靶mRNA起始密码下游100～200bp至翻译终止密码上游50～100bp范围内搜寻AA序列，并统计每个AA3端相邻19个核苷酸作为候选siRNA靶位点。反义核酸与rnai专题知识第29页提议设计siRNA不要针对mRNA5和3端非编码区(untranslatedregions，UTRs)，因为这些区域有丰富调控蛋白结合位点，而UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP(siRNAproteincomplex，核酸内切酶复合物)结合mRNA，从而影响siRNA干扰效果。最终还应将候选siRNA序列在GenBank进行BLAST检索，与非同源基因含有3个或3个以上碱基相异序列方可选取。反义核酸与rnai专题知识第30页化学合成早期RNAi试验中，dsRNA或siRNA均由化学法所合成。化学合成siRNA纯度高，合成量不受限制，且还可对siRNA进行标识，方便对其跟踪，但该方法价格昂贵，不适合用于siRNA序列筛选和长久基因缄默试验。反义核酸与rnai专题知识第31页

体外转录法合成siRNA较为经济。依据siRNA序列合成对应DNAOligo模板，再利用T7RNA聚合酶进行体外转录，分别取得siRNA正义链和反义链，然后将其退火、纯化即可得到能直接导入细胞siRNA。体外转录法最大缺点是siRNA合成量受限制，不过其价格较低，毒性小，稳定性好，效率高。体外转录法合成siRNA反义核酸与rnai专题知识第32页ConstructionofsiRNAbyT7RNApolymerase-mediatedinvitrotranscription.反义核酸与rnai专题知识第33页siRNA表示载体体外合成siRNA，不宜进行长久基因缄默研究。借助表示质粒或病毒载体在细胞内产生siRNA，使研究者无需直接操作RNA就可到达长久抑制靶基因表示目标，且载体上抗性标识有利于快速筛选出阳性克隆，这将含有更为辽阔应用前景。反义核酸与rnai专题知识第34页短发夹RNA(shRNA)shRNA表示质粒多采取RNA聚合酶Ⅲ开启子(polⅢ)。polⅢ在哺乳动物细胞内引导非编码小RNA转录，转录产物无poly(A)尾，且在转录过程中碰到连续4～5个U时转录终止。此载体最终转录出产物是经折叠形成发夹状小RNA(smallhairpinRNA，shRNA)；shRNA在细胞内被Dicer酶切割成3端带有两个U突出siRNA，进而开启RNAi，介导基因缄默。载体中间隔序列为9个核苷酸时最为有效。反义核酸与rnai专题知识第35页(A)U6orH1PolIIIpromotersdrivetheexpressionofahairpinstructureinwhichthesenseandantisensestrandsofthesiRNAareconnectedbyaloopsequence.反义核酸与rnai专题知识第36页(B)TwoU6-orH1-basedexpressioncassettesareusedtodrivetheseparatetranscriptionofthesenseandantisensestrandsinthecell.Thetwostrandswouldthenannealtoformadouble-strandedsiRNA.Anoligo-Uoverhangispresentoneachstrand.反义核酸与rnai专题知识第37页(C)APolIIpromoter(ashortenedversionofthehumanCMV)drivestheexpressionofahairpinsiRNA.Thetranscriptincludesextranucleotidesatits5endandapoly-Atail(insteadofanoligo-U)overhangatthe3end.反义核酸与rnai专题知识第38页用病毒载体介导RNAi多年来受到大家重点关注。利用病毒载体能够处理质粒转染效率低、效果不稳定且一些类型细胞不能转染等问题，从而扩充RNAi应用范围。常见病毒载体有腺病毒(Adenovirus)载体、逆转录病毒(Retrovirus)载体、慢病毒(Lentivirus)载体等。反义核酸与rnai专题知识第39页RNAi机制dsRNA被加工成小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。

dsRNA是RNAi初始诱导因子，不过dsRNA必须被Dicer酶深入加工成长度为21-23个核苷酸siRNA才能产生RNAi反应。Dicer酶属RNaseⅢ家族中第二类：两个RNaseⅢ结构域一个dsRNA结合结构域(dsRNA-bindingdomain，dsRBD)，一个解旋酶结构域(helicasedomain)一个PAZ结构域反义核酸与rnai专题知识第40页体外试验表明，人重组Dicer酶对dsRNA切割时，PAZ结构域绑定dsRNA末端，dsRNA结合结构域绑定dsRNA内部，随即经过两个RNaseⅢ结构域对dsRNA双链分别进行切割成长度约22个核昔酸siRNA片段。siRNA片段带有5‘端磷酸基团，在其3’端有2个突出核苷酸反义核酸与rnai专题知识第41页RISC装载siRNA装载siRNARISC(RNA-inducedsilencingcomplex.RISC)被称为RNA诱导缄默复合物，由各种蛋白组成，其中关键成份是具核击内切酶活性Argonaut2(Ago2)蛋白。siRNA在ATP参加下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导缄默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等各种成份组成。反义核酸与rnai专题知识第42页RNAi机制RISC/siRNA复合物中，siRNA是以单链形式存在，这说明在RISC装配过程中或之后，siRNA发生解链，被选择与RISC进行装配是双链siRNA中引导链(guidestrand)

，该链将引导RISC寻找与之匹配mRNA并进行剪切，而siRNA中另一条链称为过客链(passengerstrand)

，它从RISC复合物中游离出去，并可能被Ago2所剪切。

反义核酸与rnai专题知识第43页

RISC剪切mRNARISC装载siRNA引导链而处于激活状态，寻找和识别与之匹配mRNA，对mRNA进行剪切，这一过程与前面提及对siRNA过客链剪切过程类似。RISC剪切mRNA可能够重复使用；

RISC剪切mRNA位点普通处于siRNA5‘端数起第11个到第12个碱基相对应位置。剪切过程不依赖于ATP，不过有ATP存在情况下，ATP可能促进RISC对mRNA剪切后产物释放，或使RISC回复构象准备第二次剪切，

反义核酸与rnai专题知识第44页RNAi机制反义核酸与rnai专题知识第45页RNAi放大效应机制siRNA不但可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新dsRNA。新合成长链dsRNA一样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割循环过程，深入放大RNAi作用。这种合成-切割循环过程称为随机降解性PCR（randomdegradativePCR）。反义核酸与rnai专题知识第46页GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,.反义核酸与rnai专题知识第47页RNAi特点转录后水平基因缄默PTGS是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无对应mRNA存在这一现象

较高特异性能够非常特异地降解与之序列对应单个内源基因mRNA反义核酸与rnai专题知识第48页RNAi特点高效性相对少许dsRNA就能够使对应基因表示受抑制

可遗传性及远距离效应

RNAi基因表示效应能够突破细胞界限，传递给子一代

(可遗传给F1，但F2往往恢复为野生型。)反义核酸与rnai专题知识第49页RNAi应用1.RNA干扰介导细胞发育调控线虫中调整幼虫发育Lin14

基因受到Lin4基因控制。Lin4基因转录物经Dicer酶切割后产生一个由22个核苷酸组成miRNA，然后该miRNA能够和Lin14mRNA3‘端非翻译区中存在7个重复序列互补配对，造成该mRNA降解。人类细胞中存在几百种不一样miRNA，它们形成了一个十分复杂调控网络，在发育时间调控、造血细胞分化、细胞繁殖、细胞凋亡、组织发育等过程中饰演主要角色。果蝇中也发觉miRNA调控一套特殊基因，使其在细胞发育过程中适时表示反义核酸与rnai专题知识第50页2.RNA干扰和病毒防御RNA缄默是植物和无脊椎动物主要病毒防御机制；病毒本身既是RNA干扰诱导物，又是RNA干扰攻击目标；病毒为了抵抗RNA干扰攻击，普遍编码了RNA干扰抑制蛋白。迄今为止未发觉在病毒感染哺乳动物细胞过程中能自然诱发有效防御病毒RNA干扰反应。

反义核酸与rnai专题知识第51页基因治疗：在利用RNAi技术对HIV、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发觉，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性序列作为抑制序列可在抑制病毒复制同时防止对正常组织毒副作用。同时将抑制序列选择在特定位点，可对个别有明确基因突变恶性肿瘤细胞产生凋亡诱导作用以及抑制MDR

基因。科学家们已经应用RNA干扰技术，在各种不一样动物疾病模型中取得了良好疗效。当前，6种基于该技术药品已经在美国进入II期临床试验。反义核酸与rnai专题知识第52页RNAi在探索基因功效中应用：在RNAi技术出现以前，基因敲除（geneknockout）是主要反向遗传学（reversegenetics）研究伎俩，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。因为RNAi技术能够利用siRNA或siRNA表示载体快速、经济、简便以序列特异方式剔除目标基因表示，所以现在已经成为探索基因功效主要研究伎俩。同时siRNA表示文库构建方法建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对说明信号转导通路、发觉新药品作用靶点有主要意义。反义核酸与rnai专题知识第53页总述植物、动物、人类都存在RNA干扰现象，RNA干扰已经作为一个强大“基因缄默”技术而出现。RNAi技术与基因组学、蛋白质组学和功效蛋白质组学亲密相关，所以，RNAi本身可作为一项试验技术为生物工程及制药业等相关行业服务，从而在更深更广领域发挥其作用。动物试验已证实，能够经过RNAi方法使造成血胆固醇升高基因“缄默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢性疾病等方面临床试验也正在进行中；这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾治疗指了一条新路。反义核酸与rnai专题知识第54页RNA干扰治疗技术正在进入人体试验阶段，不过还有一些难题有待处理:①怎样在生物体内实现有效组织特异性siRNA转染;②怎样降低这种疗法对目标基因以外其它基因影响，从而防止产生副作用;③怎样实现RNA干扰效应在细胞与细胞、组织与组织间系统性扩散等。

反义核酸与rnai专题知识第55页反义核酸及药品

一、反义核酸概述：

反义核酸（antisensenucleicacid）是指与体内某RNA或DNA序列含有互补次序并能经过碱基配对与互补链杂交从而影响其目标基因表示RNA或DNA片段。反义核酸与目标基因结合后，经过位阻效应或诱导RNAase活性降解作用，在复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译等水平上，抑制或封闭目标（靶）基因表示。反义核酸也称反义寡核苷酸，最初是指与单链RNA互补一段寡核苷酸序列。反义核酸与rnai专题知识第56页

反义抑制机理：当前普遍认为反义核酸能够在复制、转录、表示3个水平上发挥作用。其机制为：在细胞核内以碱基配对原理与基因组DNA

结合，从复制与转录水平发挥反义阻止作用,这种反义技术称为“反基因治疗”(Anti-genetherapy);与引物结合,从而在复制水平上阻止基因表示;

与mRNA5'末端SD(Shine-Dalgarno)序列或核糖体结合位点结合,妨碍核糖体结合,从而妨碍翻译,或使反义RNA与mRNA形成双链,以被水解酶水解;反义核酸与rnai专题知识第57页(4)与mRNASD序列上游非编码区结合，改变mRNA二级结构，从而妨碍核糖体结合;(5)与mRNA5’末端编码区(主要是起始密码AUG)结合，阻止RNA翻译;(6)作用于mRNApolyA形成位点，阻止成熟和转运;(7)作用于mRNAR5’末端，阻止帽子结构形成;(8)结合到前体RNA外显子和内含子连接区,阻止其剪切成熟;反义核酸与rnai专题知识第58页二、反义核酸技术与药品反义核酸技术是指依据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成特定互补DNA或RNA片段（或其化学修饰产物）抑制或封闭目标基因表示技术。它包含反义RNA、反义DNA和肽核酸三大技术。第一代反义寡核苷酸药品—硫代修饰寡聚核苷酸；第二代反义寡核苷酸药品—甲氧/乙氧基反义寡核苷酸第三代反义寡核苷酸药品—肽核酸。反义核酸与rnai专题知识第59页（一）反义DNA是人工合成能与特定DNA或RNA互补结合短核酸片段，从而在DNA或RNA水平上抑制特定基因转录和翻译。反义DNA分类及特点