基因治疗的原理专家讲座

基因治疗原理

基因治疗的原理专家讲座第1页一、基因治疗策略

内容提要二、基因转移技术

三、基因干预基因治疗的原理专家讲座第2页一、基因治疗策略基因治疗的原理专家讲座第3页

（一）基因置换（genereplacement）

定义：指将特定目标基因导入特定细胞，经过定位重组，以导入正常基因置换基因组内原有缺点基因。

目标：将缺点基因异常序列进行桥正。

基因治疗的原理专家讲座第4页（二）基因添加

基因添加或称基因增补（geneaugmentation）:

经过导入外源基因使靶细胞表示其本身不表示基因。类型:在有缺点基因细胞中导入对应正常基因，而细胞内缺点基因并未除去，经过导入正常基因表示产物，赔偿缺点基因功效。向靶细胞中导入靶细胞原来不表示基因，利用其表示产物到达治疗疾病目标。基因治疗的原理专家讲座第5页（三）基因干预基因干预（geneinterference）:采取特定方式抑制某个基因表示，或者经过破坏某个基因结构而使之不能表示，以到达治疗疾病目标。基因治疗的原理专家讲座第6页（四）自杀基因治疗自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗主要方法之一。原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码酶能使无毒性药品前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而到达去除肿瘤细胞目标。基因治疗的原理专家讲座第7页（五）基因免疫治疗

经过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中抗癌免疫反应。基因治疗的原理专家讲座第8页二、基因转移技术基因治疗的原理专家讲座第9页基因转移(genetransfer)技术

1.病毒介导基因转移系统。

2.非病毒介导基因转移系统。基因治疗的原理专家讲座第10页

1.病毒介导基因转移系统

病毒载体介导基因转移效率较高，所以它也是使用最多基因治疗载体。据统计，有72%临床试验计划和71%病例使用了病毒载体，其中用得最多是逆转录病毒载体。基因治疗的原理专家讲座第11页(1)逆转录病毒载体基因治疗的原理专家讲座第12页

逆转录病毒载体特点

①逆转录病毒包膜上由env编码糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带遗传物质高效地进入靶细胞。

②逆转录病毒结构基因gag、env和pol缺失不影响其它部分活性。

③前病毒能够高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中永久表示。

④包装好假病毒颗粒（携带目标基因重组逆转录病毒载体）以芽生方式分泌至辅助细胞培养上清液中，易于分离制备。

基因治疗的原理专家讲座第13页

逆转录病毒载体主要缺点

随机整合，有插入突变、激活癌基因潜在危险；逆转录病毒载体容量较小，只能容纳7kb以下外源基因。基因治疗的原理专家讲座第14页

（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体

腺病毒是一个大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。它经过受体介导内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。

腺病毒是人类呼吸道感染病原体，但当前还未发觉与肿瘤发生相关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。基因治疗的原理专家讲座第15页腺病毒载体优点1.基因导入效率高，对人类安全；2.宿主范围广；3.基因转导与细胞分裂无关；4.重组腺病毒可经过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5kb外源基因；基因治疗的原理专家讲座第16页

腺病毒载体缺点2.宿主免疫反应造成腺病毒载体表示短暂。3.有两个步骤可能产生复制型腺病毒。4.靶向性差。

1.不能整合到靶细胞基因组DNA中。分裂增殖快细胞，导入重组病毒载体，随分裂而丢失机会增多，表示时间相对较短。基因治疗的原理专家讲座第17页

2.非病毒载体介导基因转移系统

（1）脂质体介导基因转移技术脂质体介导基因转移技术使用方便、成本低廉。

基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，能够自动形成包埋外源DNA脂质体，然后与细胞一起孵育，即可经过细胞内吞作用将外源DNA（即目标基因）转移至细胞内，并进行表示。

基因治疗的原理专家讲座第18页

（2）受体介导转移技术

将DNA与细胞或组织亲和性配体偶联，可使DNA含有靶向性。这种偶联通常经过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又经过电荷相互作用与带负电荷DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这么形成复合物可被带有特异性受体靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。基因治疗的原理专家讲座第19页

（3）基因直接注射技术不需要进行基因工程繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或一些器官组织内。

基因治疗的原理专家讲座第20页三、基因干预基因治疗的原理专家讲座第21页基因干预种类：1.反义RNA(antisenseRNA)2.干扰RNA(RNAinterference)基因治疗的原理专家讲座第22页

（一）反义RNA1.反义RNA与基因表示调控利用反义RNA对体外培养细胞进行基因表示调控，通常采取方法有两种：（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。（2）构建能转录反义RNA重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。基因治疗的原理专家讲座第23页2.受体介导反义RNA技转移术

基本原理：将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸工具。ASGP-PL反义RNA复合物能够专一性地被肝细胞表面ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐步释放出来发挥作用。

借助受体介导DNA转移方法把DNA换成反义RNA，就能够实现受体介导反义RNA转移。基因治疗的原理专家讲座第24页（二）干扰RNA

1.RNA干扰现象

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是一个由双链RNA诱发基因缄默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因表示。基因治疗的原理专家讲座第25页

2.RNA干扰机制

RNA干扰过程主要有2个步骤：

（1）小干扰性RNA（siRNA）（2）siRNA与细胞内一些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导缄默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。

该复合体可识别与siRNA有同源序列mRNA，并在特异位点将该mRNA切断。

长双链RNA被细胞内双链RNA特异性核酸酶Dicer切成21-23个碱基正确短双链RNA，称为小