流式细胞仪专题知识讲座

流式细胞仪专题知识讲座流式细胞仪专题知识讲座第1页流式细胞仪概述一、概述

流式细胞仪（Flow

Cytometer

简称FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处于快速直线流动状态中细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选技术。

流式细胞仪专题知识讲座第2页流式细胞仪机型1.台式机检测和分析

B.D.:FACSCalibur;LSRII;LSRI2.大型机分选细胞

B.D.:FACSVantage；FACSAriaBeckmanCoulter:MoFlo（DAKO）

流式细胞仪专题知识讲座第3页流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪分析速度：

普通检测1000～

5000个细胞/秒,大型机可达每秒上万个细胞。2．荧光检测灵敏度：普通能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间荧光差＞5%即可区分。3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反应被测细胞大小,普通流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。4．分辨率：通常见变异系数CV值来表示，,普通流式细胞仪能够到达<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须到达。

5．流式细胞仪分选速度：普通流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。

流式细胞仪专题知识讲座第4页流式细胞仪结构可分为五个别：(1)流动室及液流驱动系统;

(2)激光光源及光束成形系统;(3)光学系统;

(4)信号检测与存贮、显示、分析系统，(5)细胞分选系统。

流式细胞仪专题知识讲座第5页流动室及液流驱动系统流动室(Flow

Chamber或

Flow

Cell)仪器关键部件，被测样品在此与激光相交。充满了鞘液,将样品流环包，使样品流不会脱离液流轴线方向，确保每个细胞经过激光照射区时间相等。流式细胞仪专题知识讲座第6页改变样本进样速率开关,可提升采样分析速度,不过,并不提升样本流速度,而是改变了细胞间距离,样本流变宽,细胞间距离缩短,这么单位时间内流经激光照射区细胞数就增加。激光焦点处能量分布为正态分布,中心处能量最高,所以当样本速率选择高速(Hi)时,处于样本流不一样位置细胞或颗粒,受激光光照射能量不一样,从而被激发出荧光强度也不相同，这就会造成测量误差,当在检测分辨率要求高试验时如，

DNA

analysis应选取低速(Low)

流式细胞仪专题知识讲座第7页每个细胞所携带荧光物质被激发出荧光信号强弱，与被照射时间和激发光强度相关，所以细胞必须到达足够光照强度。为确保样品中细胞是一个一个分别受到光照而且受照强度十分一致,须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处

流式细胞仪专题知识讲座第8页激光光源和光学系统氩离子气体激光管：Ex488nm;氦氖离子气体激光管:Ex633nM;紫外激光管：Ex355nMViolet:Ex405nM单波长、高强度、高稳定性

流式细胞仪专题知识讲座第9页光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（普通为2片透镜、1个小孔）主要作用是将激光光源发出横截面为圆形激光光束聚焦成横截面较小椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使经过激光检测区细胞受照强度一致，最大程度降低杂散光干扰

流式细胞仪专题知识讲座第10页流动室后光学系统(1)长通滤片(LP)：使特定波长以上光经过，特定波长以下不经过。如,LP500允许500

nm以上光经过，而500

nm以下光吸收或返回。(2)短通滤片(SP)：使特定波长以下光经过，特定波长以上光吸收或返回。(3)带通滤片(BP)：允许相当窄一波长范围内光经过，普通滤片上有两个数，一个为允许经过波长中心值，另一为允许经过光波段范围。如BP

500

/

50表示其允许经过波长范围为475nm-525nm。

流式细胞仪专题知识讲座第11页绿色荧光(FITC)：LP550和BP525

橙红色荧光(PE)：LP600和BP575

红色荧光(CY5)：LP650和BP675流式细胞仪专题知识讲座第12页流式细胞仪使用调试和校准：流式细胞计在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以确保工作可靠性和最正确性能。1.激光强度2.液流速度3.测量区光路调整流式细胞仪专题知识讲座第13页开机、联机cytometer-computer；检验鞘液箱是否有足够鞘液（3L）。盖子关紧。鞘液箱处于压力下。（黑色金属板）管道没有渗漏。检验废液箱预装400ml含氯消毒液没有渗漏流式细胞仪专题知识讲座第14页在cellquest下：设置参数：PMT-voltage;compensation;shreshold;status(standby-3-4V;ready-14-15V)counter建立自己文件上机（管道密闭）：气阀关闭；”run”流式细胞仪专题知识讲座第15页PMT-voltage未染色细胞（空白对照）或者同型对照

Dotplot:FSC-SSC

线性坐标（细胞）；对数坐标（bead-CBA)显示不一样细胞群体，关注群体-设门Dotplot:FL1/FL2;FL1/FL3;FL2/FL3对数坐标阈值降低杂颗粒：细胞碎片；坏死细胞；红细胞；血小板等流式细胞仪专题知识讲座第16页关机上含有3ml含氯消毒液（10％），底下托架推至一边连续1min。回归托架，在run状态下，高速继续上样5min。改用蒸馏水，重复上述过程。探针继续放在蒸馏水中。换至”standby“.脱机关电源

流式细胞仪专题知识讲座第17页常见问题1.没有信号出现

“ready”：域值参数设置过高或过低；域值没有选择正确参数（通常为FSC）；进样器堵塞；密封圈破损；联机失败；

“standby“：run按钮；液流系统漏气（鞘液箱未密封；样品管破损；密封圈破损；）2.上样速度过高：

样品流中有气泡；域值过低；样品浓度过高；鞘液系统中有空气3.上样速度过低：域值设定过高；样品未充分混匀；样品稀释过大；进样针堵塞

流式细胞仪专题知识讲座第18页Fluorescencecompensation:单标识荧光调整赔偿FL2-%FL1流式细胞仪专题知识讲座第19页需要调整赔偿参数对FL1/FL2；FL2/FL3；FL3/FL4对照设置-以检测带有FITC/PE/APC样品为例1.空白、阴性对照2.单标识对照：FL1(FITC);FL2(PE);FL4(APC)3.混合对照：以上对照两两组合；3个混合流式细胞仪专题知识讲座第20页FL1FL2赔偿与荧光强度成正比未赔偿个别赔偿充分赔偿流式细胞仪专题知识讲座第21页UncompensatedvsCompensatedFL1FL2FL1-%FL2FL2-%FL1FL1-%FL2流式细胞仪专题知识讲座第22页1.流式细胞仪参数物理参数前向角参数(FSC)反应细胞相对大小,与细胞直径平方亲密相关。普通选取FSC作阈值，来排除样品中各种碎片及鞘液中小颗粒，以防止对被测细胞干扰。侧向角参数(SSC)反应细胞相对粒度或内部复杂度，对细胞膜、胞质、核膜折射率更为敏感，可提供相关细胞内精细结构和颗粒性质信息。

流式细胞仪数据分析流式细胞仪专题知识讲座第23页流式细胞仪专题知识讲座第24页ForwardAngleLightScatter(FSC)FALSSensorLaserFSC

与入射光在同一方向散射光，与细胞表面积相关流式细胞仪专题知识讲座第25页FALSSensor90LSSensorLaser90DegreeLightScatterSSC与入射光成90°光，与细胞内部复杂度相关，颗粒密度流式细胞仪专题知识讲座第26页依据FSC/SSC能够将全血中淋巴细胞，单核细胞和粒细胞分开流式细胞仪专题知识讲座第27页荧光参数自发荧光：未经荧光染色，细胞内部荧光分子经激光照射后发出荧光信号。自发荧光细胞成份：核黄素，细胞色素等。

死亡细胞自发荧光较高

需要设置阴性对照。

特征荧光：经标有特异荧光素单克隆抗体染色后经激光激发发出荧光。流式细胞仪专题知识讲座第28页FITC,Alexa488,GFP,CFSE,Fluo-3,R123PE,PIAPC,alexa647,APC-cy7PerCP,PE-cy5,PE-cy5.5,7-AAD,PIPE-cy7流式细胞仪专题知识讲座第29页LaserFluorescenceDetectorsFALSSensorFluorescence

detector(PMT3,PMT4etc.)流式细胞仪专题知识讲座第30页激发光波长(Ex)发射光波长(Em)488488488488488488488488488633633633FITCAlexa488PEPI7-AADPE-Cy5PerCPPE-Cy5.5PE-Cy7APCAPC-Cy7Alexa647519519578630670668667695785660785668FL1FL2FL3FL4流式细胞仪专题知识讲座第31页Fluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmWavelengthProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm流式细胞仪专题知识讲座第32页ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)Protein流式细胞仪专题知识讲座第33页PropidiumIodide400nm500nm600nm700nmPIDNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm流式细胞仪专题知识讲座第34页Allophycocyanin(APC)Protein632.5nm(HeNe)ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm流式细胞仪专题知识讲座第35页怎样选择荧光偶联抗体荧光偶联抗体亮度S/N(Positive/negative):4-6fold

PE,PE-cy7,PE-cy5,APC>APC-cy7,alexa647>FITC,alexa488F/PFITC,PerCP:2-9;APC,PE:1;PE-Cy7,APC-Cy7:1,N;抗原密度

高丰度抗原：任何荧光素；低丰度抗原：PE，APC染色指数自发荧光

高：APC；低：FITC非特异形结合

FcR;荧光本身流式细胞仪专题知识讲座第36页直接标识特异性信号:弱非特异性结合:低对照：相同荧光素标识同型对照；或者预先用抗体起源动物血清封闭流式细胞仪专题知识讲座第37页间接标识特异性信号:强,5-62ndAb/1stAb;非特异性结合:高对照：一抗起源同型对照或血清＋二抗流式细胞仪专题知识讲座第38页Avidin-BiotinmethodbiotinylatedprimaryAbbiotinavidinbiotinylateddye流式细胞仪专题知识讲座第39页荧光抗体搭配理论上，不一样通道检测参数能够同时进行检测。不过假如进行3个荧光参数检测，尽可能选择只需要调整一对参数之间赔偿荧光。如，FL1+FL2+FL4;FL1+FL3+FL4;注意：PE-Cy5和APC不能同时检测。流式细胞仪专题知识讲座第40页流式细胞仪数据显示和分析一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图。1．单参数数据显示和分析—

一维直方图横坐标：散射光(FSCorSSC-线性)或荧光信号(FL1,2,3,4-对数)相对强度值；纵坐标：表示细胞数。依据阴性对照设定适当“门”（直线门），仪器计算机就会给出测定值（包含阳性细胞%和平均荧光强度）。流式细胞仪专题知识讲座第41页流式细胞仪专题知识讲座第42页2.双参数数据显示和分析

表示：一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。二维图：横坐标-FSC/SSC/FL1/2/3/4；纵坐标-FSC/SSC/FL1/2/3/4

依据阴性对照设置“四方格”标尺,分为四个区：LL-双阴性；LR和UL-单阳性；UR-双阳性；每个区都能够用%和平均荧光强度表示。也能够设置“门”。流式细胞仪专题知识讲座第43页流式细胞仪专题知识讲座第44页流式细胞仪专题知识讲座第45页3．三参数数据显示和分析

用每两个数据组成一对（可组成6对数据）表示：一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。流式细胞仪专题知识讲座第46页数据分析率(%gate)平均荧光强度

算数平均荧光强度(meanfluoresenceintensity,MFI)MFI=(x1+x2+x3...+xn)/n

正态分布数据使用

几何平均荧光强度(geomeanfluoresenceintensity,GMFI)GMFI=(x1*x2*x3...*xn)nthroot.

经对数转换后呈正态分布举例：有五个细胞，其荧光强度分别为1,100,100,100,10000MFI=1+100*3+10000/5=2060GMFI=(1*100^3*10000)1/5=100

中位数(median)=100

变异系数（CV）=100流式细胞仪专题知识讲座第47页率和平均荧光强度应用普通说来，%和MFI/GMFI都能够用来表示所关注细胞群体某个参数度量。有时候%没有改变，不过MFI/GMFI有改变。流式细胞仪专题知识讲座第48页流式细胞仪专题知识讲座第49页流式细胞仪应用细胞周期检测细胞周期：G1期、S期、G2期和M期。各期细胞DNA含量以下：G1(M1)=2C；G2和M(M2)=4C；S(M3)=2C-4C。正常细胞：各周期时相细胞数百分比是恒定；恶性病变：各周期时相细胞数百分比是非均一。总倾向是：异倍体百分比升高；异倍体肿瘤恶性程度高、复发率高、转移率高及死亡率高；二倍体及近二倍体肿瘤预后很好。

流式细胞仪专题知识讲座第50页流式细胞仪专题知识讲座第51页DNA指数：表示DNA含量异常程度。标准二倍体细胞：普通样品应采取同种或同个体正常细胞。血液学研究中通常以正常人外周血淋巴细胞作为标准二倍体细胞。需要指出是，在汇报DNA测定结果时必需包含G0/G1峰变异系数，即C.V值，若有多个DNA干系则要给出各个G0/G1峰C.V值。用于肿瘤临床诊疗总体依据是：a.正常二倍体DI=1.0，判断为阴性；b.出现二个或多个能够分辨G0/G1峰则可判断为阳性；c.虽无显著G0/G1峰分化现象，但峰C.V值较大，则可依据DI数个及其它有判别意义征状给出参考性诊疗。

流式细胞仪专题知识讲座第52页应用范围：1.临床肿瘤：测试肿瘤细胞对药品敏感性；2.临床微生物：对细菌DNA和RNA含量进行测量，进行微生物判定、医学常规中细菌抗生素敏感试验和传染活性测定。

凋亡检测：出现亚凋亡峰。流式细胞仪专题知识讲座第53页免疫表型分析对外周血或免疫器官中白细胞免疫荧光分析依据细胞表面分化抗原能够进行：

亚群判定：CD3+CD4+/CD3+CD8+T;CD19+B;CD56+CD16+NK;CD14+Mo;CD34+HSC,CD11c+HLA-DR+DC;CD123+BDCA2+pDC;etc.

特定亚群绝对数和百分比检测：AIDs：CD4+T/CD8+T降低：CD4+T细胞绝对数降低

SLE：粒细胞和淋巴细胞绝对数降低；

特定亚群一些分子表示改变：CD3+CD4+T细胞表示CD25水平；表示CCR7水平

寻找新亚群：FoxP3+Treg;CD11b+Gr1+MSC;NK1.1+NK;

信号分子表示和活化：CpG刺激PBMCs后，CD123+BDCA2+pDC中p-P38表示；

细胞因子分泌：anti-CD3+anti-CD28刺激PBMCs后，CD3+CD4+T细胞分泌IFN-

水平流式细胞仪专题知识讲座第54页信号分子表示和活化

WesternBlot:只能检测整体细胞表示情况，不能够区分是那个亚群表示情况；而且WB检测需要一定数量细胞，少许细胞有可能检测不出来。细胞因子表示：

ELISA只能检测上清中分泌，一样不能够区分是那个亚群分泌；假如样品量少只能检测一个细胞因子。

流式细胞仪专题知识讲座第55页流式细胞术检测信号分子活化流式细胞仪专题知识讲座第56页流式细胞术检测细胞因子分泌流式细胞仪专题知识讲座第57页流式细胞仪专题知识讲座第58页白血病/淋巴瘤免疫分型；

判断起源：髓系/淋巴系;T系/B系判断分期：

判断预后：比如：CALLA仅存在于B细胞正常发育期前B细胞、早期B细胞以及80%～90%急性淋巴细胞性白血病。所以，检测CALLA表示情况能够区分淋巴细胞性和髓性白血病。用CALLA结合其它一些成熟B细胞表面标志，如CD19，CD20，CD24（B4，B1，BA-1）将能证实大个别B细胞起源肿瘤。

流式细胞仪专题知识讲座第59页HLA组织配型及HLA与一些疾病关系；

HLA-B27检测：强制性脊柱炎移植：HLA配型干祖细胞定量及成份分析；流式细胞仪专题知识讲座第60页定量分析免疫球蛋白类型和量：血清中IgM;IgG1,IgG2a,IgG2b;IgG3;IgE等。细胞因子分泌：血清或培养上清

CBAflexset(BD):能够同时检测少许上清中各种细胞因子/趋化因子/免疫球蛋白类型和亚类/信号分子表示和定量。细胞功效分析如：吞噬功效-采取荧光标识大分子（糖类-dextran;蛋白-OVA）；细胞增殖水平-CFSE细胞凋亡研究

AnnexinV/PI

细胞周期流式细胞仪专题知识讲座第61页FACSArrayFACSLSRIIFACSCaliburRed/NIRAPC/APC-Cy7FL4/FL3YellowPEFL2Parametersreporter流式细胞仪专题知识讲座第62页定量分析免疫球蛋白类型和量：血清中IgM;IgG1,IgG2