免疫实验医学宣教专家讲座

免疫标识技术（immunolabellingtechnique）:

是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标识抗体或抗原进行抗原抗体反应。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。免疫实验医学宣教专家讲座第1页免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶标识抗原或抗体进行抗原抗体反应。

辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应特异性高灵敏度：酶催化底物显色高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面抗原。免疫实验医学宣教专家讲座第2页一、原理

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一个固相酶免疫测定方法，当前广泛应用于各种抗原和抗体检测。其基本原理是：将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标识抗体或抗原联结，并保持并保留酶活性，然后加入酶反应底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色深浅可与对应抗原或抗体量相关。在本试验中，以辣根过氧化物酶标识抗人IgG抗体，与对应抗原IgG结合，标识酶可催化底物（邻苯二胺）起显色反应，从而指示特异性抗原抗体反应存在。免疫实验医学宣教专家讲座第3页二、材料：1、人IgG包被微量酶标反应板，（1：1万，1：2万，1：4万，1：8万，1：16万）2、酶标抗人IgG抗体稀释液、洗涤液（PH7.4，0.01MPBS-Tween20）、底物溶液，3、微量移液器、移液头、吸水纸、洗瓶、湿盒、37℃恒温箱等。免疫实验医学宣教专家讲座第4页三、方法：1.人IgG包被微量酶标反应板：取人IgG各100ul，分别加入第1至5孔，设第6孔为对照。置37℃恒温箱2小时，取出，移入4℃冰箱过夜。取出，用洗涤液洗3次，5分钟/次。(略）2.用含小牛血清（BSA）PH7.4PBS封闭，置37℃恒温箱，30分钟，取出。用洗涤液洗3次，3~5分钟/次。（略）3.用微量移液器吸收100ul酶标抗人IgG抗体，分别加入第6至1孔。置湿盒中，于37℃恒温箱中孵育30分钟。4.取出酶标板，用洗涤液洗3次，3~5分钟/次。5.按第6孔至第1孔次序，每孔各加100ul底物溶液，置37℃恒温箱中10-15分钟。6.观察显色反应。免疫实验医学宣教专家讲座第5页用PBS洗涤3次（将洗板液加入每孔，3min后倾去），以洗去未结合游离酶标抗体。不一样浓度IgG100ul/孔酶标板126543酶标抗人IgG抗体底物观察显色免疫实验医学宣教专家讲座第6页四、结果1654321~5孔，伴随包被抗原浓度降低，颜色逐步变淡6孔（对照）无色五、结论

ELISA可简便、快速、定量地检测抗原或抗体免疫实验医学宣教专家讲座第7页操作注意事项：1、正确掌握微量移液器使用方法：一档取样，二档加样。2、正确洗涤酶标板：勿使洗涤液溢出，造成交叉污染洗涤后应尽可能甩干孔内残液。3、注意加样次序，加样品时应注意从最高稀释度逐一加至最低稀释度。4、底物OPD有一定致癌作用，故操作时应小心，勿使底物沾染试验台等器材。5，枪头（移液头）忌丢入试验台微生物专用废液缸内。免疫实验医学宣教专家讲座第8页ELISA分类√直接法（CompetitiveELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标识抗原或抗体检测液相中可溶性抗原或抗体√间接法（IndirectELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标识二抗检测液相中未知抗体√双抗体夹心法（SandwichELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标识一抗检测液相中可溶性抗原免疫实验医学宣教专家讲座第9页SandwichELISAindirectELISA免疫实验医学宣教专家讲座第10页ELISA检测抗原

Ag+Ab*↔Ag-Ab*免疫实验医学宣教专家讲座第11页ELISA检测抗体

Ab+Ag*↔Ab-Ag*免疫实验医学宣教专家讲座第12页ELISA检测抗体Ag+Ab1↔Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*↔Ag-Ab1-Ab2*

免疫实验医学宣教专家讲座第13页免疫实验医学宣教专家讲座第14页间接ELISA（可测各种细菌或病毒抗体，用途广泛）显色

免疫实验医学宣教专家讲座第15页免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中对应抗原或抗体进行检测。标识技术：将可被探测示踪物质用化学方法与化合物连接。标识免疫分析：用可微量或超微量检测示踪剂标识抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。免疫标识技术补充免疫实验医学宣教专家讲座第16页放射免疫技术免疫荧光技术酶免疫技术三大经典标识技术三大经典标识技术免疫实验医学宣教专家讲座第17页放射免疫RIA以标识抗原与反应系统中未标识抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。

免疫放射IRMA以过量标识抗体与抗原非竞争结合，采取固相免疫吸附载体分离游离和结合标识抗体。放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA其它放射免疫技术－原理免疫实验医学宣教专家讲座第18页二、放射免疫技术－惯用放射性核素

125I

3H射线γβ理化性

活泼

差核素丰度

>90%－半衰期60.2d12.3y标识方法简单复杂标识设备低廉昂贵测量条件简单复杂惯用标识核素免疫实验医学宣教专家讲座第19页荧光抗体技术荧光免疫测定均相荧光免疫测定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）

非均相荧光免疫测定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应特异性与荧光技术敏感性相结合，反抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。荧光免疫技术类型免疫实验医学宣教专家讲座第20页荧光抗体技术基本原理

荧光素标识抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察展现特异荧光抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对本身抗体进行定性和滴度测定。免疫实验医学宣教专家讲座第21页Immunofluorescence,IF免疫实验医学宣教专家讲座第22页荧光显微镜

利用一定波长激发光对样品进行激发，产生一定波长荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

免疫实验医学宣教专家讲座第23页病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)荧光抗体技术应用免疫实验医学宣教专家讲座第24页免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）荧光抗体技术应用免疫实验医学宣教专家讲座第25页主要试剂:

酶标识抗体或抗原酶标物特点：

免疫学活性酶对底物催化活性抗原抗体反应特异性+酶高效催化反应专一性酶免疫测定法原理及特点免疫实验医学宣教专家讲座第26页特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标识试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广新方法。原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）特异性反应酶对底物显色反应反抗原或抗体进行定位、定性或定量测定分析

原理及特点免疫实验医学宣教专家讲座第27页辣根过氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶活性中心RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为主要ELISA中应用最为广泛标识用酶惯用酶酶和酶作用底物免疫实验医学宣教专家讲座第28页酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相非均相固相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原定位

液体标本中抗原或抗体定性和定量酶免疫技术分类免疫实验医学宣教专家讲座第29页碱性磷酸酶（AP）

菌源性AP肠粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫测定

惯用酶酶和酶作用底物免疫实验医学宣教专家讲座第30页HRP底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有各种

H2O2为受氢体，HRP对受氢体专一性很高

惯用底物酶和酶作用底物免疫实验医学宣教专家讲座第31页HRP常见底物

邻苯二胺OPD四甲基联苯胺TMB5-氨基水杨酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS惯用底物酶和酶作用底物免疫实验医学宣教专家讲座第32页OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛底物。

HRP常见底物

酶和酶作用底物免疫实验医学宣教专家讲座第33页AP底物

β-Gal底物

对-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）经AP作用后产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。惯用底物酶和酶作用底物免疫实验医学宣教专家讲座第34页酶免疫技术关键组成部分

酶结合物（conjugate）酶标识物经过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物

酶标识抗体或抗原免疫实验医学宣教专家讲座第35页

酶联免疫吸附试验

免疫实验医学宣教专家讲座第36页底物显色定性或定量分析原理包被反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗涤使结合在固相上抗原抗体复合物与未结合分离1234一、基本原理免疫实验医学宣教专家讲座第37页固相抗原或抗体

酶标识物（酶结合物）

酶反应底物

三个必要试剂

二、方法类型及反应原理免疫实验医学宣教专家讲座第38页双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：

二价或二价以上较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA检测抗原方法免疫实验医学宣教专家讲座第39页免疫实验医学宣教专家讲座第40页1、已知抗体包被于载体表面3、加酶标抗体与抗原结合4、加酶作用底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包被于载体表面2、加待检物无抗原与抗体结合3、加酶标抗体无抗原结合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY免疫实验医学宣教专家讲座第41页竞争法

方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。

应用：用于只有一个抗原决定簇小分子半抗原（药品、激素等）ELISA检测抗原方法免疫实验医学宣教专家讲座第42页免疫实验医学宣教专家讲座第43页洗涤洗涤竞争法测抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合3、加酶作用底物不显色或显色弱3、加酶作用底物显色1、已知抗体包被于载体表面1、已知抗体包被于载体表面2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合YE免疫实验医学宣教专家讲座第44页间接法方法

用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一个酶标抗抗体检测各种与抗原对应抗体应用

惯用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等测定ELISA检测抗体方法免疫实验医学宣教专家讲座第45页免疫实验医学宣教专家讲座第46页1、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig抗体4、加酶作用底物不产生颜色洗涤洗涤洗涤洗涤间接法测抗体-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+免疫实验医学宣教专家讲座第47页双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似应用：乙型肝炎表面抗体ELISA检测抗体方法免疫实验医学宣教专家讲座第48页竞争法原理：类似检测抗原竞争法

应用：乙型肝炎病毒关键抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)检测ELISA检测抗体方法免疫实验医学宣教专家讲座第49页捕捉法

应用：

病原体急性感染诊疗中IgM型抗体

甲型肝炎HAV-IgM抗体

乙型肝炎病毒关键HBc-IgM抗体ELISA检测抗体方法免疫实验医学宣教专家讲座第50页捕捉法

原理：抗人IgMμ链抗体包被捕捉待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标识特异性抗原抗体底物显色

免疫实验医学宣教专家讲座第51页洗涤洗涤洗涤洗涤捕捉法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，与特异性抗体结合4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色免疫实验医学宣教专家讲座第52页人IL-2定量酶联检测

BAS-ELISA(生物素-亲和素ELISA)免疫实验医学宣教专家讲座第53页

一、原理

ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)是一个固相酶免疫测定方法，广泛应用于各种抗原或抗体微量检测，其基本原理是将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原－抗体反应在固相表面进行，经过洗涤将固相上抗原－抗体复合物与液相中游离成份分离，再利用各种操作方法，测定可溶性抗原或抗体。

BAS-ELISA是在常规ELISA原理基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间高度放大作用，而建立一个检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取一个碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这么，结合了酶亲和素分子与结合有特异性抗体生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又因为酶在碰到对应底物时催化作用而呈色，到达检测未知抗原(或抗体)分子目标。免疫实验医学宣教专家讲座第54页本试验采取双抗体夹心ELISA法。抗人IL-2单抗包被于酶标板上，标准品中IL-2会与单抗结合，游离成份被洗去。加入生物素化抗人IL-2抗体和辣根过氧化物酶标识亲和素。生物素和亲和素特异性结合；抗人IL-2抗体与结合在单抗上人IL-2结合而形成免疫复合物，游离成份被洗去。加入显色剂，若反应孔中有IL-2，辣根过氧化物酶会使无色显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-2浓度与OD450值之间呈正比，绘制标准曲线。免疫实验医学宣教专家讲座第55页二、材料（人IL-2ELISA试剂盒）

1.1ng/ml人IL-2标准品2.标准品稀释液3.生物素化抗人IL-2抗体（1:100）4.酶结合亲和素（1:100）5.洗涤液6.显色剂（过氧化氢－四甲基联苯胺）7.终止液8.抗人IL-2单抗包被板条9.封板胶纸免疫实验医学宣教专家讲座第56页三、操作步骤

1.包被抗体：用0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板反应孔中加0.1ml，4℃过夜(18-24小时)。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

2.配制不一样浓度标准品：

孔号12345678NS(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

人IL-2(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.1

稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:256免疫实验医学宣教专家讲座第57页3.加样：将稀释不一样浓度标准品各100ul加入反应孔1~8孔中，同时第9孔作空白孔。37℃孵育60分钟，洗涤4次，0.5