细胞工程花药和花粉培养

主要内容7.1花药培养7.2花粉培养7.3花药和花粉培养中白化苗问题7.4操作实例细胞工程花药和花粉培养第1页植物花药/花粉培养历史

Guha和Maheshwari（1964）曼陀罗花药培养Nitsch和Norreel(1973)烟草花粉培养（游离小孢子培养）

Chu（1973）小麦花粉培养（早期花药培养主要依靠小孢子自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生基因频率较低，效率极低）

80年代后期到90年代期间，花培技术快速发展。许多作物小孢子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。

90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养基因型也相续成功Konzak(1999)。细胞工程花药和花粉培养第2页花粉和花药区分二者异同点1.培养目标相同，均取得小孢子植株。2.花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培3.花粉培养没有药壁组织干扰，可计数小孢子产胚率；能观察雄核发育全过程，单倍体产量高。但技术更复杂。细胞工程花药和花粉培养第3页花粉和花药培养作用1、作物育种（1）缩短育种周期：常规育种需4-6年取得纯系，而小孢子培养仅需一年。供体植株小孢子（n）花粉植株（n）加倍纯合植株DH（2n）花培雄核发育自然加倍人工一年内取得纯系细胞工程花药和花粉培养第4页（2）提升了目标基因型选择效率

例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb纯合单株常规方法：AAbb出现概率为1/16，而且不能将AAbb与Aabb区分开。ABAbaBabABAABBAABbAaBBAaBbAbAABbAAbbAaBbAabbaBAaBBAaBbaaBbaaBbabAaBbAabbaaBbaabb细胞工程花药和花粉培养第5页（3）诱变育种中作用植株不受显隐性影响，在诱变育种中能在当代及时取得突变个体，加倍后成为稳定纯系。

细胞工程花药和花粉培养第6页花药离体培养过程：

细胞工程花药和花粉培养第7页7.1花药培养花药培养：是指把发育到一定阶段花药接种在适宜培养基上，使其中花粉发育成单倍体植株过程。花药培养过程主要步骤：1、选取花粉单核期花蕾和幼穗；2、进行适当预处理；3、对外植体进行表面消毒；4、无菌条件下取出花药接种到适当培养基上，在适宜条件下培养；5、花粉胚或花粉愈伤组织发育到适宜阶段后，转入植株再生培养基形成花粉植株；6、在试管苗阶段或移栽成活以后进行花粉植株染色体加倍；7、炼苗，移入土壤栽培。细胞工程花药和花粉培养第8页一、材料选择花药外植体选择是否适当，直接关系到培养能否功。细胞工程花药和花粉培养第9页1.供体植株基因型材料遗传背景对花药培养影响很大，不一样植物甚至不一样品种之间对花药培养反应都有差异，所以选择适当品种常是培养能否成功关键原因。如水稻中粳稻比籼稻轻易培养。细胞工程花药和花粉培养第10页2.供体植株生理状态供体植物生理对诱导频率有直接影响。如多年生植物中，幼年植物比老龄植物花药诱导频率高；草本植物中生长健壮花药诱导频率较高；烟草开花早期花药比后期更轻易产生花粉植株；供体植株生长条件对花粉发育及其对离体培养反应也有主要影响。细胞工程花药和花粉培养第11页3.花粉发育时期不一样植物花粉对离体培养有其特定最敏感发育时期，所以，选择发育到适当时期花粉是提升花粉植株诱导频率主要原因。比如烟草和水稻花粉从单核早期至双核期都可接收诱导；小麦和玉米处于单核期花粉培养效果最好；而天竺葵则从四分体花粉得到最正确效果。对于大多数植物来说，单核期花粉比较轻易培养。细胞工程花药和花粉培养第12页发育时期物种减数分裂时期草莓、番茄种四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期玉米不一样物种诱导胚胎发生最正确小孢子发育时期细胞工程花药和花粉培养第13页检验花粉发育时期方法：染色法：如用醋酸洋红等染色制片，然后在显微镜下观察。水稻单核靠边期判定细胞工程花药和花粉培养第14页二、预处理在花药接种之前，先对其进行预处理能够提升诱导率。预处理方法：1.低温预处理：普通可将带有叶鞘穗子（如稻、麦类）或花蕾（如烟草、油菜等）用纱布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中预处理。2.高温预培养：在花药分离后，把培养物放置在较高温度条件下培养一段时间，然后再转移到常温条件下继续培养。3.甘露醇预处理将大麦花药用过滤除菌0.3mol/L甘露醇溶液预培养3-5天，然后转移到过滤除菌FHG液体培养基上漂浮培养，其中小孢子散落到培养液中形成大量花粉胚。4.其它方法：离心预处理、乙烯利预处理、PEG预处理及磁场预处理细胞工程花药和花粉培养第15页三、培养基培养基组成对花药培养成功率有显著影响。1.植物生长物质：不一样植物甚至不一样品种之间对生长物质需求都有可能不一样。2.碳源：大部分培养基中使用碳源都是以蔗糖来提供，同时它还起着调整培养基渗透势作用，不一样植物及不一样培养阶段对蔗糖浓度要求不一样。3.其它成份：基本培养基中各无机成份对花药离体培养中愈伤组织产生有较大影响。细胞工程花药和花粉培养第16页四、培养方式1.液体培养优点：能够用过滤法除菌，其中生物活性物质不会因常规高压灭菌而破坏，所以比在琼脂培养基上培养效果更加好。缺点:液体培养轻易造成培养物通气不良，尤其是伴随愈伤组织重量增加，轻易沉到培养基底部，因为供养较差，可能会对愈伤组织分化能力产生严重影响。细胞工程花药和花粉培养第17页2.双层培养：固体-液体双层培养基制作方法是先在35mm×10mm小培养皿中铺1-1.5mL琼脂培养基，待固化后在其表面再加0.5mL液体培养基，然后将花药接种在液体培养基中进行培养。双层培养优点是花药在培养早期能够从活性高液体培养基汲取营养，花粉胚长大后不会淹没。能够在通气良好条件下分化成植株。细胞工程花药和花粉培养第18页3.花药-花粉分步培养：先将花药接种在液体培养基（含Ficoll）上进行漂浮培养，花粉能够从花药中自然释放出来，散落在液体培养基中。及时用吸管将花粉从液体培养基中取出，植板于琼脂培养基上，使其处于良好通气环境中，可使花粉植株诱导率大大提升。细胞工程花药和花粉培养第19页4.条件培养利用条件培养基，即预先培养过花药液体培养基进行花药培养，可使花药培养效率大大提升。细胞工程花药和花粉培养第20页五、培养条件1.温度：离体花药对温度敏感性比较高。2光照：不一样植物对光照要求不一样。细胞工程花药和花粉培养第21页六、花粉植株倍性及染色加倍花药植株倍性：花药培养中，由花粉发育成花粉植株并不像所期望那样全是单倍体，其中不但有二倍体还有多倍体和非整倍体。花粉植株中出现自然加倍主要是因为核内有丝分裂造成，核内有丝分裂与接种花粉时期、培养基中植物生长物质种类和水平、花粉植株发生方式及愈伤组织继代培养时间长短有直接关系。细胞工程花药和花粉培养第22页倍性判定方法有：1、染色体直接计数法通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。

2、间接判定（1）扫描细胞光度仪判定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中DNA含量确定细胞倍性，材料使用量可少到1cm²。（2）细胞形态学判定法单位面积上气孔数及保卫细胞中叶绿体大小和数目与倍性含有高度相关性。（3）植株形态学判定法叶片保卫细胞大小、单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不坚固。细胞工程花药和花粉培养第23页（4）杂交判定法自交或测交判定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。（5）分子标识判定包含生化标识（如同工酶标识）和分子标识（如RFLP、RAPD、AFLP等）细胞工程花药和花粉培养第24页染色体加倍单倍体植株不能正常坚固，只有经过染色体加倍、育性才能恢复，而且在遗传上是纯合，为了取得更多二倍体植株，除了有意识利用上述自发核内有丝分裂产生二倍体外，还需要经过人工方法使单倍体植株染色体加倍，成为纯合二倍体。细胞工程花药和花粉培养第25页染色体加倍（一）茎段培养将单倍体植株茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。因为单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合二倍体植株。（二）化学试剂诱变有秋水仙素、Oryzalin、trifluralin、APM等。1、秋水仙素诱导（1）浸泡法无菌条件下以一定浓度秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。（2）生长锥处理秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。（3）培养基处理将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素相同培养基中继续培养诱导胚状体。2、除草剂诱导（毒性小，引发植株变异几率小）细胞工程花药和花粉培养第26页细胞工程花药和花粉培养第27页细胞工程花药和花粉培养第28页水稻花药栽培细胞工程花药和花粉培养第29页水稻花药栽培细胞工程花药和花粉培养第30页7.2花粉培养花粉培养：即小孢子培养，是将花粉粒从花药中分离出来进行培养技术，花粉培养和花药培养一样都是取得植物单倍体有效方法。细胞工程花药和花粉培养第31页一、材料选择和预处理和花药培养类似，供体植株基因型和栽培条件、花粉发育时期和预处理等，对花粉培养能否成功有着主要影响。影响原因：1.不一样植物及同一植物不一样基因型材料在一样试验条件下，花粉培养诱导频率差异很大。2.供体植物生理状态对花粉胚胎发生也有很大影响。普通从发育健壮植株上取花粉进行培养效果很好。3.花粉培养还受供体植株生长条件影响，如温度、光照等原因。选择适当花粉发育时期是提升植株花粉诱导频率主要原因。不一样作物适宜花粉发育时期不一样。和花药培养一样，适当预处理能够提升花粉培养成功率。细胞工程花药和花粉培养第32页二、花粉分离所得花粉需满足以下条件：1.花粉成活率较高2.发育整齐3.要到达一定数量4.无菌、无杂质分离方法有：1.挤压法2.散落法3.器械法（1）小型搅拌器（2）超速旋切机假如需要，能够把以上三种方法分离所得花粉深入用密度梯度离心纯化细胞工程花药和花粉培养第33页二、花粉培养方法1.培养基和花药培养类似，花粉培养中多使用过滤除菌液体培养基，其中铵态氮浓度普通比较低，通常加入一些有机氮源。普通情况下，对于花粉胚状体发生所需植物生长物质，不一样种类、浓度效果不一样，不一样供体材料反应也不一致。细胞工程花药和花粉培养第34页二、花粉培养方法2.培养方法细胞工程花药和花粉培养第35页7.2花药和花粉培养中白化苗问题植株白化苗现象细胞工程花药和花粉培养第36页一、白化苗产生原因1.外因1）光照条件影响2）

温度条件影响

3）其它环境原因影响2.内因1）叶绿素等光合色素合成酶基因突变2）质体分化和叶绿体发育相关基因突变3）其它内源原因一些非光合系统蛋白编码基因突变、叶绿体蛋白转运受阻和核-基质组之间相互作用及不亲和性都可能引发百花现象发生。细胞工程花药和花粉培养第37页二、白化苗控制