多肽与蛋白质类药物

关于多肽与蛋白质类药物一、多肽和蛋白质药物的基本概念第一节概述（一）、多肽类药物

多肽是α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物,它也是蛋白质水解的中间产物。N条多肽链按一定的空间结构缠绕纠结就构成了蛋白质。大分子蛋白质水解会生成多肽。第2页,共96页，2024年2月25日，星期天1、多肽药物的功能特性

多肽是生物体内重要的生物活性成分，主要有以下生理功能特性：☆（1）作为生理调节的活性分子，参与调节各种生理活动和特性。☆（2）多肽在生物体内的浓度很低（1×10-7mol/L就可发挥活性，有的甚至更低），但生理活性很强，具有多种多样的生化功能。如胆囊收缩素在千万分之一就可发挥作用。☆

（3）分子小，结构易于改造，可通过化学合成的方法生产。如由中国首先合成的牛胰岛素，就属于一种含51个氨基酸的多肽。☆（4）活性多肽的合成过程往往是由蛋白质精加工剪切转化而来的，许多多肽之间都具有共同的来源、相似的结构。第3页,共96页，2024年2月25日，星期天2.多肽类药物的分类

主要有多肽激素、多肽类细胞生长调节因子、含有多肽成分的组织制剂：1、多肽激素（1）脑垂体多肽激素；促皮质素（ACTH），促黑激素,催产素，加压素（2）下丘脑激素；促甲状腺激素释放激素，生长素抑制激素，促性腺激素释放激素主要多肽类药物（3）甲状腺激素；甲状旁腺激素，降钙素（4）胰岛激素；胰高血糖素，胰解痉多肽（5）胃肠道激素；胃泌素，胆囊收缩素，肠泌素，肠血管活性肽，抑胃肽，缓激肽，P物质（6）胸腺激素；胸腺素，胸腺肽，胸腺血清因子第4页,共96页，2024年2月25日，星期天2、多肽类细胞生长调节因子

包括表皮生长因子(EGF)，转移因子(TF)，心钠素(ANP)等。3、含有多肽成分的组织制剂

这是一类临床疗效确切，但其中所含的具体有效成分还不十分明了的制剂，主要包括骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、蜂毒、蛇毒、安胎素、神经营养素、胎盘提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素等。第5页,共96页，2024年2月25日，星期天（二）蛋白质药物

蛋白质药物可分为蛋白质类激素、血浆蛋白质、蛋白质类细胞生长调节因子、胶原蛋白等。主要蛋白质类药物有以下几种：1.蛋白质激素（1）垂体蛋白激素----生长素，催乳素，促甲状腺素，促黄体生成激素，促卵泡激素（2）促性腺激素----人绒毛膜促性腺激素(HCG)，绝经尿促性腺激素，血清促性腺激素（3）胰岛素及其它激素生长素释放抑制因子，是一种人脑激素，治疗肢端肥大症，50万个羊脑提取5mg.工程菌：7.5L培养液可得到5mg.肢端肥大症第6页,共96页，2024年2月25日，星期天4.粘蛋白:

胃膜素，硫酸糖肽，血型物质A和B等。5.胶原蛋白:

明胶，阿胶6.碱性蛋白:硫酸鱼精蛋白7.蛋白酶抑制剂:胰蛋白酶抑制剂，大豆胰蛋白酶抑制剂8.植物凝集素:PHA，ConA3.蛋白质类细胞生长调节因子干扰素α、β、γ（IDN）,白细胞介素（1~16）（IL）神经生长因子等2.血浆蛋白质白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血纤蛋白等

硫酸鱼精蛋白是一种强碱，能与强酸性肝素钠或肝素钙形成稳定的盐而使肝素失去抗凝作用。抗肝素药。用于因注射肝素过量所引起的初出血.第7页,共96页，2024年2月25日，星期天

FDGF,IL,CSF,IFN,EPO,hGH的中文名称IFN：干扰素IL：白细胞介素hGH：生长激素FDGF：成纤维细胞衍化生长因子

CSF：克隆刺激因子EPO：红细胞生成素第8页,共96页，2024年2月25日，星期天二、多肽和蛋白质类药物特点

1)基本原料简单易得多肽和蛋白质类药物主要以20种天然氨基酸为基本结构单元依序连接而得,代谢物氨基酸为人体生长的基本营养成分,可通过农产品发酵而制备。2)药效高，副作用低,不蓄积中毒多肽和蛋白质类药物本身是人体内源性物质或针对生物体内调控因子研发而得，通过参与,介入,促进或抑制人体内或细菌病毒中生理生化过程而发挥作用,副作用低,药效高,针对性强，不会蓄积于体内而引起中毒。第9页,共96页，2024年2月25日，星期天3)用途广泛，品种繁多，新型药物层出不穷多肽和蛋白质类药物是目前医药研发领域中最活跃,进展最快的部分，是二十一世纪最有前途的产业之一。将20种基本氨基酸按不同序列相互连接,可得到品种繁多,可用于治疗各种类型疾病的多肽和蛋白质类药物。众多新型多肽和蛋白质类药物在治疗艾滋病，癌症，肝炎，糖尿病，慢性疼痛效果显著。4)研发过程目标明确,针对性强借助生命科学领域取得的大量研究成果,包括对各类疾病发病机理的揭示,对体内各种酶,辅酶,生长代谢调节因子的深入认识,可以针对性开展多肽和蛋白质类药物的研发。第10页,共96页，2024年2月25日，星期天多肽和蛋白质类药物研发技术与方向1)化学合成方法2)改造生物活性多肽及现有多肽药物3)提高活性多肽及现有多肽药物档次4)针对具生物活性的多肽天然产物研发5)生物技术制备多肽和蛋白质药物第11页,共96页，2024年2月25日，星期天三、多肽及蛋白质类药物的生产方法（1）化学合成法：化学合成法只能生产少部分多肽类药物。化学合成法借助化学催化剂，按一定的氨基酸序列秩序形成肽键。蛋白质药物一般具有复杂的空间结构，而形成这些空间结构还需要一些特殊的细胞因子参与起辅助作用，这些细胞因子是化学合成过程中无法提供的，所以化学合成不能用于生产相对复杂的蛋白质类药物。

1953年，人类用化学合成法合成了有生物活性的多肽----催产素。（1）化学合成法：（2）天然动植物及重组动植物提取法（3）微生物及重组微生物发酵法第12页,共96页，2024年2月25日，星期天（2）天然动植物及重组动植物提取法

通过生化工程技术，从天然动植物中分离纯化。由于天然动植物中的有效成分含量过低，杂质太多，引起人们对重组动植物的重视。重组动植物只通过基因工程技术手段，将药物基因或能对药物基因起调节作用的基因转导入动植物细胞，以提高动植物合成药用成分的能力，再经过生化分离，制得生物制品。

t-PA(tissue-plasminogenactivator)译成中文为组织纤溶酶原激活剂，人体内自然存在，同时也是临床上用于急性心肌梗死的一种生物蛋白药物，有18个半胱氨酸，9对二硫键第13页,共96页，2024年2月25日，星期天t-PA组织型纤溶酶原激活剂的转基因羊第14页,共96页，2024年2月25日，星期天（3）微生物及重组微生物发酵法

通过基因工程菌发酵生产多肽和蛋白质药品，生产中期短、成本低、产品质量高。通过基因工程技术手段，把人体细胞内含有的合成某一多肽或蛋白质的基因分离出来，在结合一定的载体，转入特定的微生物细胞，通过微生物细胞将该多肽或及蛋白质的基因表达出来，以生产该类药品用于临床。

目前，世界上生产的多肽和蛋白质药品，绝大多数均经过此方法生产。第15页,共96页，2024年2月25日，星期天第二节动植物提取法生产多肽和蛋白质类药物一、概述（一）材料的选择

蛋白质类药物的来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的，易于提取的无害生物材料。对天然蛋白质类药物，为了提高质量、产量和降低生产成本，对原料的种属，发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定要求，使得纯化工作相对容易。第16页,共96页，2024年2月25日，星期天

(1)种属：牛胰含胰岛素单位比猪胰岛素多，牛为4000IU/Kg胰脏，猪为3000IU/Kg胰脏.抗原性猪比牛低。猪与人胰岛素相比，只有1个氨基酸差异，而牛有3个氨基酸差异。（2）发育生长阶段：幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采用幼龄动物。肝细胞生产因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎儿、胎猪或胎牛肝中获得的。若用成年的动物，必须经过肝脏部分切除手术后，才能获得富含肝细胞生长因子的原料。猪胰脏牛胰脏第17页,共96页，2024年2月25日，星期天（3）生物状态：动物饱食后宰杀，胰脏中胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌是胆汁排空，对胆汁收集不利。（4）原料来源：

血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，而稳定性以猪颚下腺来源为好，因其不含蛋白质水解酶。第18页,共96页，2024年2月25日，星期天

（6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求：

大肠杆菌的产品提取大多要求破壁，有些可能会产生毒素。枯草杆菌和酵母菌虽然可克服上述毛病，但表达的蛋白质成分有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷。

动物细胞较好，如果用肿瘤细胞要考虑其安全性。（5）原料解剖学部位：

猪胰脏中，胰脏尾部含激素较多，而胰脏头部分含消化酶较多。如果分别摘取则可提高各产品收得率。胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化腺。

猪胃第19页,共96页，2024年2月25日，星期天(二)蛋白质类制品的分离纯化方法(1)根据分子大小轻重设计的方法。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。(2)根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。(3)按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。(4)按稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性法表面变性法等。(5)按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法等.第20页,共96页，2024年2月25日，星期天二、主要多肽类药物的制备1、胸腺素（thymocin）

胸腺位于胸骨后面，紧靠心脏，呈灰赤色，扁平椭圆形，分左、右两叶，由淋巴组织构成。青春期前发充良好，青春期后逐渐退化，为脂肪组织所代替。胸腺是造血器官，分泌胸腺素，能产生淋巴细胞，并运送到淋巴结和脾脏等处。这种淋巴细胞对机体的细胞免疫具有重要作用。

生长激素和甲状腺素能刺激胸腺生长，而性激素则促使胸腺退化。第21页,共96页，2024年2月25日，星期天

人体和动物都有免疫系统，包括特异性免疫和非特异性免疫，其中特异性免疫又分为体液免疫系统和细胞免疫系统。当某些外源生物（如细菌）或生物大分子（如蛋白质），也叫抗原，进入动物体后，会刺激动物体本能地产生相应的抗体，引起免疫应答，从而将进入的外源生物或蛋白质分解或清除。

细胞免疫主要指机体受到异己物质抗原的刺激后，一类小淋巴细胞——依赖胸腺的T细胞发生增生、分化，直接攻击靶细胞或间接地释放一些淋巴因子从而使机体达到免疫的过程。体液免疫则是当机体受到抗原刺激后，来源与骨髓的小淋巴细胞——B细胞（即B型淋巴细胞）进行增生并分化为浆细胞，进而合成各类免疫球蛋白（即抗体），然后在体液中发挥免疫作用的过程。第22页,共96页，2024年2月25日，星期天

T淋巴细胞来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。T淋巴细胞与激活的血小板T淋巴细胞第23页,共96页，2024年2月25日，星期天嗜中性粒细胞Neutrophil嗜中性粒细胞Neutrophil嗜中性粒细胞Neutrophil嗜中性粒细胞Neutrophil嗜中性粒细胞Neutrophil嗜酸性粒细胞Eosinophil嗜酸性粒细胞Eosinophil嗜酸性粒细胞Eosinophil嗜酸性粒细胞Eosinophil嗜碱性粒细胞Eosinophil嗜碱性粒细胞Eosinophil嗜碱性粒细胞Eosinophil单核细胞Monocyte嗜碱性粒细胞Eosinophil嗜碱性粒细胞Eosinophil淋巴细胞Lymphocyte第24页,共96页，2024年2月25日，星期天胸腺素（thymosin;thymin），

-----是由胸腺分泌的一类促细胞分裂的含28个氨基酸残基的具有生理活性的多肽激素。可诱导造血干细胞发育为T淋巴细胞，具有增强细胞免疫功能和调节免疫平衡等作用。

-----临床上常用的胸腺肽是从小牛胸腺发现并提纯的有非特异性免疫效应的小分子多肽。第25页,共96页，2024年2月25日，星期天（1）结构和性质

胸腺素组分5是由80℃热稳定的40-50种多肽组成的混合物，分子量在1000~15000之间，等电点在3.5~9.5之间。

胸腺素组分5

胸腺素组分5这一名称来源于生产加工过程，即以小牛胸腺为原料，采用一定的工艺提取纯化得到的第5组分。α区---pI5.0以下多肽。β区---pI5.0~7.0以下多肽γ区---pI7.0以上多肽（种类较少）

根据等电点不同，可以将胸腺素组分5中所含多肽分为α、β、γ三个区，

胸腺素组分5中，所含的多肽中并非每一种都有免疫活性，有活性的称为胸腺素，如胸腺α1、α5、α7，无活性的称为多肽，如β1等。第26页,共96页，2024年2月25日，星期天胸腺素组分5

作用与用途：作为免疫调节剂①原发性和继发性免疫缺陷病，如反复上呼吸道感染等；②自身免疫病，如肝炎，肾病，红斑狼疮，类风湿关节炎、重症肌无力等；③变态反应性疾病，如支气管哮喘等；④细胞免疫功能减退的中年人和老年人疾病，并可抗衰老。⑤肿瘤的辅助治疗。第27页,共96页，2024年2月25日，星期天（2）生产工艺胸腺绞碎胸腺碎块生理盐水离心提取提取液（组分1）加热，去杂蛋白80℃，15min上清夜（组分2）丙酮沉淀－10℃丙酮粉（组分3）pH7.0磷酸盐缓冲液上清夜（组分4）加硫酸铵0.5饱和度调pH4盐析物超滤pH8Tris－HCl超滤液SephadexG－25脱盐，干燥胸腺素（组分5）硫酸铵0.25饱和度第28页,共96页，2024年2月25日，星期天二、主要蛋白质类药物的制备一、人血浆白蛋白制剂的制备（preparationofhumanbloodplasmaalbumin）（1）结构和性质（structureandcharacter）

人血是一种红色混浊的、具有一定腥味与粘滞性的液体。用适当的抗凝剂除去其中的有形成分（如红血球）而得到淡黄色、半透明的液体叫血浆。第29页,共96页，2024年2月25日，星期天血浆中除含有大量的水分以外，还含有血浆蛋白等溶质。白蛋白（albumin）又称清蛋白，白蛋白是血浆蛋白中含量最高（55%）、分子量最小、分子数最多的一类蛋白质。白蛋白对治疗因失血、创伤、烧伤等引起的休克，脑水肿和大脑损伤性所致的脑压增高，防止低蛋白血症，肝硬化或者由肾病引起的水肿与腹水等严重疾病具有良好疗效。白蛋白为单链分子，由584个氨基酸残基组成，N端为天门冬氨酸，C端为亮氨酸，分子量为6.6×104，在离子强度为0.15时，pI为4.7，易溶于水，在60%硫酸铵饱和度以上沉淀。对酸较稳定，受热变性。第30页,共96页，2024年2月25日，星期天从人体中分离的白蛋白有两种：一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。

二者作用相同，后者价格低于前者，且用量多于前者，但目前已停产。血+混合抗凝剂草酸铵草酸钾离心上清血浆总蛋白：6.2-7.9%白蛋白：3.8-4.8%水：90-92%现常用肝素、柠檬酸钠

血（无抗凝剂）→自然凝固→分离出血清（无纤维蛋白酶原、凝血因子等）第31页,共96页，2024年2月25日，星期天（2）白蛋白生产工艺路线

利凡诺,NaHCO3pH8.6,离心分离络合物蒸馏水，NaCl，HClpH1.28~1.45

，40℃解离，离心离心液浓缩超滤浓缩液灭活病毒

65℃，1h；60℃，10h热处理液除菌除菌过滤白蛋白液干燥冷冻干燥白蛋白去杂蛋白人血浆（%）乳酸依沙吖啶上清液盐析物浓缩液

处理液

人血丙种球蛋白哦1mol/LHCl调PH7.0(NH4)2SO4盐析超滤除盐2~6℃沉降除菌过滤解离后pH至5.5-6.0离心分离出上清液冻干品白色疏松物体将解离混合物溶液用0.5mol/LHCl调节pH至5.5-6.0，加NaCl至0.15%～0.2%，充分搅拌、40℃过夜解离（8-10h）。25℃白蛋白含量占95%以上，水分<1%，水溶后pH为6.6-7.2，硫酸铵残量<0.01%，细菌学和热原质检测合格。

第32页,共96页，2024年2月25日，星期天（3）工艺要点

①络合对于络合所要求的pH值，可以略高些，这样，白蛋白络合完全，络合物形成一个相当硬的块，倾倒上清液方便，损失少。但不能太高，以防络合血浆中的其它蛋白，影响解离与白蛋白制剂的纯度。若pH值偏低，络合不完全，络合物松软，甚至成汤状，不利于倾去上清液。血浆搅拌用NaHCO3调节pH至8.5-8.7之间，缓慢加入与血浆等体积的2.3%利凡诺溶液，边加边搅拌，充分络合后。静置2~4h，分离上清与络合物沉淀。第33页,共96页，2024年2月25日，星期天②解离生产中要严格控制溶液的温度。25℃左右室温，络合物形成一个硬块，利于去上清和解离。温度太低，虽然不影响络合，但络合物呈稀糊状，倾倒上清液时常会丢失部分络合物，而且络合物内残存较多的利凡诺的水溶液。解离温度要维持在40℃左右，是解离反应的最适温度。解离液的pH值在1.28~1.45之间，解离效果良好。络合物中加入解离液并搅拌均匀后，将解离后混合溶液pH值控制在6.0左右较理想。第34页,共96页，2024年2月25日，星期天以解离后解离混合溶液pH值决定加入解离液的体积。解离后解离混合液的pH值高于6.5时，表明加入的解离液少了，有部分络合物未被解离开；低于5.85，表明加入的解离液多了，解离过度。这两种情况下，解离效果均不佳。在沉淀中加约二分之一血浆体积的灭菌蒸馏水解离所得到的络合物沉淀，将解离混合物溶液用0.5mol/LHCl调节pH至5.5-6.0，加NaCl至0.15%～0.2%，充分搅拌、40℃过夜解离（8-10h）。第35页,共96页，2024年2月25日，星期天③去杂蛋白：白蛋白具有生物活性，凡是使蛋白质变性的温度都会使白蛋白变性。65℃条件下变性1h，离心分离出上清液。④热处理：在60±0.5℃条件下处理10h，灭活病毒。

⑤检验方法：冻干品白色疏松物体。白蛋白含量占95%以上，水分<1%，水溶后pH为6.6-7.2，硫酸铵残量<0.01%，细菌学和热原质检测合格。

白蛋白含量占95%以上，水分<1%，水溶后pH为6.6-7.2，硫酸铵残量<0.01%，细菌学和热原质检测合格。

第36页,共96页，2024年2月25日，星期天二、绒膜促性激素（HCG）的制备（1）HCG的性质（characterofHCG）

HCG(humanchorionicgonadotrophin)即人绒毛膜促性腺激素，是由胎盘的滋养层合体细胞分泌的一种糖蛋白，它是由α和β二聚体的糖蛋白组成。易溶于水，pI为3.2-3.3。妇女妊娠45-70天，尿中HCG含量可达30000-50000IU/24h。

治疗女性不育症，神经性皮炎。男性性功能过低症和隐睾症，子宫出血和习惯性流产。临床用途：第37页,共96页，2024年2月25日，星期天孕妇尿[粗制]尿：苯甲酸：乙醇/1：0.075：5）用HCl调pH4-5HCG(粗品）提取NaACpH4.8提取液透析水，5℃以下透析内液吸附（CMSepharoseCI-6B）羧甲基琼脂糖凝胶吸附后交换剂洗涤Ⅰ，Ⅱ峰NaAC,pH4.8,pH5.9洗涤后交换剂洗脱NaAC,pH8.5洗脱液冷冻干燥

—30℃HCG精品

溶解蒸馏水，10℃以下HCG溶液透析pH6.8,5℃以下透析内液吸附羟基磷灰石，pH6.8吸附物解吸0.5mmol/L,1.0mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS),pH6.8解吸液干燥—30℃HCG纯品（2）HCG生产工艺路线搅拌1h静置2-3h加10倍量的4℃1/15mol/LpH8.5、0.2mol/L的醋酸盐缓冲液洗脱，得到的第3峰即为HCG。

吸附物在搅拌下加入95%乙醇至苯甲酸全部溶解有絮状沉淀产生醋酸盐吸附粗品苯甲酸—乙醇饱和液第38页,共96页，2024年2月25日，星期天孕妇尿，用HCl调节PH=4-5，加入苯甲酸-乙醇饱和液（孕妇尿：苯甲酸乙醇饱和液：乙醇=1：0.075：5），搅拌1小时，静置2-3小时。上清液1+上清液2合并，在5℃以下，用蒸馏水进行透析。取透析内液进行离子交换层析。先将CM-Sepharose柱用0.01mol/L的醋酸盐缓冲液进行平衡，将样品加到层析柱上。HCG粗品中加入10倍量的4℃、0.067mol/L、PH=4.8的醋酸盐缓冲液，搅拌提取4小时，离心，取上清液1。离心后的沉淀物再用10倍量的4℃、0.067mol/L、PH=4.8的醋酸盐缓冲液提取，取上清液2。过滤，弃滤液，得沉淀吸附物。搅拌下加入95%乙醇，直到苯甲酸全部溶解为止，即有絮状沉淀物产生。静置过夜，离心，沉淀物用95%的乙醇和丙酮洗涤，干燥，得HCG粗品。先用0.01mol/L、PH=4.8的醋酸盐缓冲液洗出洗脱峰-1再用0.01mol/L、PH=5.9的磷酸盐缓冲液冲出洗脱峰-2再用0.2mol/L、PH=8.5的醋酸盐缓冲液冲出洗脱峰-3从洗脱峰-3上得到的就是HCG。-30℃以下冷冻干燥，得HCG精品HCG精品在10℃以下的蒸馏水中溶解，溶解液用0.5mol/L、PH=6.8的磷酸盐缓冲液进行透析。透析内液进行羟基磷灰石柱层析。步骤：（1）安装羟基磷灰石柱层析柱。

（2）用0.5mol/L、PH=6.8的磷酸盐缓冲液平衡。

（3）样品上柱先用0.5mol/L、PH=6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，得峰-1再用1.0mol/L、PH=6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，得峰-2从洗脱峰-2上得到的就是HCG纯品。-30℃以下冷冻干燥，得HCG产品。第39页,共96页，2024年2月25日，星期天（3）工艺要点①吸附粗品：HCl调孕妇尿至pH4-5，加苯甲酸—乙醇饱和液（孕妇尿：苯甲酸乙醇饱和液：乙醇=1:0.075:5）搅拌1h静置2-3h，过滤，弃滤液，得吸附物。在搅拌下加入95%乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮状沉淀产生，静置过夜，离心，沉淀用95%乙醇和丙酮洗涤，干燥得粗制品。②提取：加10倍量的4℃1/15mol/L、pH4.8醋酸盐缓冲液，搅拌4h，离心，取上清液。沉淀再提取2h。合并两次提取液，弃去沉淀。第40页,共96页，2024年2月25日，星期天③离子交换层析：CM-Sepharose柱（离子交换柱）用0.01mol/L的醋酸盐缓冲液平衡后样品上柱。依次用pH4.8、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和pH5.9、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤出两个峰（杂质）。再用pH8.5、0.2mol/L的醋酸盐缓冲液洗脱，得到的第3峰即为HCG。④羟基磷灰石柱层析：柱用pH6.8、0.5mmol/L磷酸盐缓冲液平衡。样品用pH6.8、0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液进行层析上柱。洗脱先用pH6.8、0.5mmol/L再用pH6.81.0mmol/L的磷酸盐缓冲液。得到I、II活性峰。然后冷冻干燥。HCG纯品的比活性为10,000-12,000IU/mg蛋白质。羟基磷灰石：又称羟磷灰石，Ca5(PO4)3(OH)）其中OH-基能被氟化物、氯化物和碳酸根离子代替，生成氟基磷灰石或氯基磷灰石,而钙离子可以被多种金属离子通过发生离子交换反应代替，形成对应金属离子的M磷灰石（M代表取代钙离子的金属离子）。在水相溶剂中不溶，可用做蛋白质纯化的吸附剂。第41页,共96页，2024年2月25日，星期天写成（Ca10(PO4)6(OH)2）的形式以突出它是由两部分组成的：羟基与磷灰石。羟磷灰石是人体骨骼组织的主要无机组成成分。植入体内后，钙和磷会游离出材料表面被身体组织吸收，并生长出新的组织。有研究证明羟磷灰石的晶粒越细，生物活性越高。牙齿表面的珐琅质的主要成份亦是羟磷灰石。第42页,共96页，2024年2月25日，星期天三、动物来源生物制品制备的实例

胰岛素广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有200万个胰岛，胰岛由α-、β-和δ-三种细胞组成，其中β-细胞制造胰岛素，α-细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素，δ-细胞制造生长激素抑制因子。1、胰岛素（insulin）的制备

胰岛素在β-细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在的，进而分解为胰岛素进入血液循环。显微镜下的胰岛β-细胞第43页,共96页，2024年2月25日，星期天促进合成代谢第44页,共96页，2024年2月25日，星期天胰岛素的性质：

胰岛素由由二条链、51个氨基酸组成，，A链21个氨基酸、B链30个氨基酸。胰岛素是所有蛋白质中研究最清楚的一个蛋白。

不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链二硫桥中间的第8、9和10位上的三个氨基酸及B链C末端人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸,抗原性比其他来源的胰岛素要低。

B链接肽

A21B30第45页,共96页，2024年2月25日，星期天

牛胰岛素的分子量为5733，猪为5764，人为5784。

胰岛素的等电点为5.30--5.35。

胰岛素在pH4.5～6.5范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解；在90%以上乙醇或80%以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。在高浓度锌的溶液中，pH6～8时胰岛素溶解度急剧下降。第46页,共96页，2024年2月25日，星期天（2）工艺路线猪胰脏提取3h86%-88%乙醇，5%草酸，提取液碱化氨水，pH8-8.4碱化液酸化硫酸，pH3.6-3.8,5℃酸化液浓缩30℃以下，减压浓缩至浓缩液去脂速热速冷去脂溶液盐析NaCl,pH2-2.5盐析物蒸馏水、丙酮、氨水（pH4.2~4.3）去除酸性蛋白滤液锌沉淀氨水，Zn（Ac）2，pH6.0沉淀除碱性蛋白，结晶Zn（Ac）2，丙酮、氨水，pH8.0，5℃以下，柠檬酸,用氨水调pH6.0,补加丙酮，结晶洗涤，干燥水、丙酮、乙醚胰岛素精品猪胰岛素生产的工艺路线

沉淀10-15℃比重为1.04-1.06离心去除酸性质白沉淀4℃放置过夜；收集沉淀。

，6.5%2%放置3-4d慢速搅拌3-5h使结晶析出结晶完全3.6%醋酸锌溶液20%第47页,共96页，2024年2月25日，星期天工艺流程图示取上清液进行锌沉淀上清液用氨水调节PH=6.2-6.4加入3.6%的醋酸锌溶液，加入量为溶液量的20%再用氨水调节PH=6.04℃下，放置过夜收集沉淀，用冷丙酮洗涤洗涤后的沉淀物进行干燥，得胰岛素粗品。盐析物除酸性蛋白操作盐析物加入7倍量的蒸馏水进行溶解再加入3倍量的冷丙酮，用氨水调节PH=4.2-4.3补加丙酮。使得丙酮：水=3：7搅拌后过夜，离心，除去酸性蛋白质沉淀浓缩液迅速升温，然后迅速降温，除去脂肪。去脂液用NaCl溶液进行盐析，盐析外液PH控制在PH=2.0-2.5之间。提取液用PH=8.0-8.4的氨水碱化4小时，除去沉淀。碱化液用PH=3.6-3.8的硫酸，在5℃时酸化4小时，除去沉淀。酸化液，在30℃下进行减压浓缩至比重为1.04-1.06。猪胰脏绞成碎末，加入2.3-2.6倍的86%-88%的乙醇+5%的草酸，10℃-15℃之间提取3小时。胰岛素粗品除碱性蛋白质，每克粗品加入2%的柠檬酸溶液50ml+6.5%的醋酸锌溶液2ml+丙酮16ml然后再用冰水稀释至100ml，使样品充分溶解。冷却至5℃以下，用氨水调节PH=8.0，过滤，除去碱性蛋白质沉淀。滤液进行结晶操作滤液用10%的柠檬酸溶液调节PH=6.0补加丙酮，使得溶液中的丙酮含量达到16%慢速搅拌3-5小时，使结晶析出再在5℃左右放置3—4天，使结晶完全析出收集结晶，用丙酮、乙醚反复脱水，真空干燥，得结晶胰岛素纯品。第48页,共96页，2024年2月25日，星期天（3）工艺要点①提取：绞碎胰脏，加2.3-2.6倍的86%-88%乙醇和5%的草酸，提取3h。②浓缩：30℃减压浓缩至比重为1.04-1.06为止。③除酸性蛋白：加入7倍量的蒸馏水溶解，再加3倍量冷丙酮，用氨水调pH至4.2-4.3，补加丙酮，离心去除酸性质白沉淀。④锌沉淀：用氨水调pH为6.2-6.4，加入3.6%醋酸锌溶液（20%浓度），再用氨水调pH至6.0，4℃放置过夜；收集沉淀。⑤除碱性蛋白、结晶：每克加冰冷的2%柠檬酸溶液50mL，6.5%醋酸锌溶液2mL，丙酮16mL，用冰水稀释至100mL，使充分溶解；冷至5℃以下，用氨水调至pH至8.0，过滤；滤液用10%柠檬酸溶液调pH6.0，补加丙酮，慢速搅拌3-5h使结晶析出；再转入5℃左右放置3-4d，使结晶完全；收集结晶，用丙酮、乙醚脱水后，真空干燥，即得结晶胰岛素。第49页,共96页，2024年2月25日，星期天3、注解（1）离体后，蛋白水解酶类能分解胰岛素，使之失活。因此，要立即深冻，先在-30℃以下急冻后转入-20℃保存备用。如用液氮或干冰速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率.（2）胰岛素结构修饰，可对胰岛素分子进行修饰和改造，以改变某些性质，如提高降血糖能力、延长体内半衰期、抗热变性、抗蛋白水解酶的降解等。（3）酶促半合成人胰岛素。经胰蛋白酶的转酰胺作用，将猪胰岛素转化为人胰岛素B30。再用离子交换层析纯化，可得到高纯度人胰岛素。（4）重组DNA技术制造人胰岛素，人工合成的人胰岛素克隆到大肠杆菌中生产人胰岛素。第50页,共96页，2024年2月25日，星期天

蛋白质工程技术改造的速效胰岛素机理是（D）A.将猪胰岛素B30位改造为丙氨酸，使之和人胰岛素序

列一致B.将A21位替换成甘氨酸，B

链末端增加两个精氨酸，使之在pH4溶液中可溶C.将B29位赖氨酸用长链脂肪酸修饰，改变其皮下扩散和吸收速度D.将人胰岛素B28位与B29位氨基酸互换，使之不易形成六聚体第51页,共96页，2024年2月25日，星期天第三节基因工程法生产多肽和蛋白质类药物一、生产用微生物的来源及发酵特性。1.大肠杆菌宿主菌特性优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉。缺点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白，以包涵体形式存在需要分离纯化后将肽链散开后重新进行折叠；再有，外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。第52页,共96页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌中，常用表达调控方式有温度型启动子和乳糖操纵子型启动子。温度型启动子来源于λ噬菌体，受cI阻碍蛋白抑制。cI蛋白由CIts857基因（857bp）编码，该基因的表达与温度有关。当温度处于低温（一般37℃以下）时，该基因能活跃的表达出cI蛋白，抑制住温度型启动子启动的基因的表达。一旦温度升高到42℃，该基因表达关闭，不合成cI蛋白，解除温度型启动子启动的基因的表达，从而启动位于其下游的外源基因的表达。国内重组γ干扰素工程菌正式利用此原理进行表达控制。

一般，将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，是表达产物不会影响细胞的生长，当宿主细胞的数量达到饱和时，在进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷。第53页,共96页，2024年2月25日，星期天乳糖操纵子型启动子必须经过乳糖诱导才能启动。当达到所需工程菌密度后，向培养基中加入乳糖或乳糖类似物，对其进行诱导，就可开启外源基因的表达。注意：加入乳糖或乳糖类似物，对其进行诱导时培养基中不能含有葡萄糖，葡萄糖的存在有抑制作用。国内很多以大肠杆菌为宿主菌的工程菌，均采用此法进行外源基因表达控制。第54页,共96页，2024年2月25日，星期天2.酵母宿主菌特性

酵母宿主菌常用巴斯德毕赤酵母，也称甲醇酵母。其可利用甲醇为唯一碳源进行生长代谢，因为该酵母细胞内存在甲醇氧化酶基因AOX1，该基因属于诱导型，其启动子只有在以甲醇为唯一碳源前提下，才能正确表达甲醇氧化酶基因AOX1并翻译为醇氧化酶。

将需要表达的外源基因置于含有AOX1启动子的载体上，作为控制。

酵母可在一般培养基是上生长，当到一定密度后，其他碳源耗尽，加入甲醇，酵母可表达外源基因，合成所需的蛋白药物成分巴斯德毕赤酵母第55页,共96页，2024年2月25日，星期天

Pichia.pastoris(巴斯德毕赤酵母)酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列。染色体重组第56页,共96页，2024年2月25日，星期天

甲醇酵母细胞表达的蛋白质药物，与人体的蛋白质相近，有利于药物使用后的免疫原性问题。这主要是因为

----甲醇酵母存在类似于人体细胞那样的蛋白质修饰系统，例如，能对蛋白质药物进行N-和O-糖基化修饰，能主动切除原核细胞表达蛋白质所特有而真核生物不具有的甲硫氨酸。第57页,共96页，2024年2月25日，星期天（二）干扰素(interferon,IFN)

干扰素（IFN）是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮系统（人体免疫系统的一种）、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白。这种蛋白具有多种生物活性，包括抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。

干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞naturalkillercell，NK）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。第58页,共96页，2024年2月25日，星期天第59页,共96页，2024年2月25日，星期天α型干扰素（IFN）来源于白细胞，也有部分淋巴细胞能合成，简写为IFN-αβ型干扰素（IFN）来源于成纤维细胞及部分类淋巴细胞，简写为IFN-βγ型干扰素（IFN）来源于T细胞，简写为IFN-γ

根据干扰素的细微结构还可以对其分亚类，例如IFN-α可再分为IFN-αⅠb，IFN-αⅠa，IFN-αⅡb等。

干扰素（IFN）是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。有α型、β型和γ型及许多亚型。第60页,共96页，2024年2月25日，星期天作用与用途

由于干扰素的抗病毒作用，抗细胞分裂及免疫调节作用，可用于：（1）用于病毒性疾病、普通感冒，疱疹性角膜炎，带状疱疹，水痘、慢性活动性乙型肝炎。（2）用于恶性肿瘤、成骨肉瘤，乳腺癌，多发性骨髓瘤，黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等。（3）用于由于病毒引起的良性肿瘤，可控制疾病发展。第61页,共96页，2024年2月25日，星期天2.生产工艺

干扰素生产的传统方法是----

对能诱导产生干扰素的细胞进行培养，例如人白细胞、成纤维细胞、T淋巴细胞等，然后通过诱导剂进行诱导，然后进行分离除杂，获得干扰素产品。

这方法由于要进行人的细胞培养，操作起来比较麻烦、产量低、成本高，因此，逐渐被现代的基因工程菌发酵所代替。第62页,共96页，2024年2月25日，星期天诱导产生干扰素生产工艺人白细胞启动诱生100μ/ml人α－干扰素37℃，12h启动白细胞正式诱生仙台病毒37℃，12h白细胞培养物离心分离2500rpm粗制α－干扰素KSCN处理；HClpH3.5沉淀1乙醇除杂5℃上清液1二次酸除杂蛋白；HClpH5.5~5.8上清液2沉淀分离；NaOHpH8.0沉淀2KSCN处理；PBS，pH5.2上清液3酸沉淀；HClpH3.0沉淀3溶解PBS，NaOHpH7.0~7.5溶解液透析透析液α－干扰素PBS（Na2HPO4-12H2O）磷酸盐缓冲液

第63页,共96页，2024年2月25日，星期天工艺过程：1）分离灰黄层:

取献血者血液（每份400ml）采入含抗凝血剂的塑料袋内，离心后分出血浆，小心吸取黄灰层，每份血可吸13-15ml，约为血中细胞的40％-50％，放置4℃冰箱过夜。第64页,共96页，2024年2月25日，星期天2）氯化铵处理:

每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，在加入总体积9倍量的0.83％的氯化铵溶液，混匀，4℃放置10min。然后离心20min，收集沉淀细胞，做成悬浮液，再用氯化铵处理一次，融解残存的红细胞。取沉淀的白细胞并悬浮于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温培养液稀释成107个/ml。培养液的基础成分为Eagle’s培养基3）起动诱生:

取稀释的细胞悬浮液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100μ/ml,置37℃水浴搅拌培养。4）正式诱生:

起动后的白细胞加入仙台病毒（在10天年龄鸡胚中培养48-72小时，收获尿囊液），使其最后浓度为100-150血凝单位/ml，在37℃搅拌培养过夜。5）收获:

次日将培养物离心30min，吸取上清液即得粗制干扰素。第65页,共96页，2024年2月25日，星期天

将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾0.5mol/L，用2mol/LHCl调pH=3.5，离心去上清液，得沉淀1。

沉淀1加入原体积1/5的冷乙醇（94%），离心去沉淀得上清液1。上清液1用HCl调pH=5.5，离心去沉淀，再HCl调pH=5.8，离心得上清液2和沉淀2。沉淀2中加入原体积1/50的甘氨酸-HCl缓冲溶液（pH=2）溶解，检测，得IFN1。上清液2用HCl调pH=8.0，用HCl调pH=5.5，得沉淀3，

沉淀3中加入原体积1/50的0.1mol/L的PBS，用0.5mol/L硫氰化钾（pH=8）溶解，pH降至5.2，离心得上清液3和沉淀4.6）纯化:将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾处理等。Na2HPO4-12H2O第66页,共96页，2024年2月25日，星期天

沉淀4加入原体积1/25000，pH=8的0.1mol/L的PBS溶解，调pH=7-7.5，对PBS（pH=7.2）透析，过夜，离心收集上清液，检测，得IFNB，上清液3用HCl调pH=3，离心的沉淀5，沉淀5中加入原体积1/5000，pH=8的0.1mol/L的PBS溶解，用NaOH调pH=7-7.5，对PBS（pH=7.2）透析，过夜，离心收集上清液，检测，得IFN-A。每份备灰黄层约能制备100万单价的纯化干扰素。

此法特点是一次纯化量大，回收率高于60%，经济，方便，易于普及，效价克达到1.2×108U/ml，比活力为2.2×106U/mg（蛋白）。IFN-A中干扰素含量占回首干扰素82%，比活力也比较高，IFN1的比活力较低（5×104U/mg（蛋白）），一般可作为外用滴鼻剂活滴眼剂。第67页,共96页，2024年2月25日，星期天基因工程干扰素的生产

1973年Cohen讲两种不同的DNA分子体外进行重组，并用大肠菌进行表达，是大量、廉价制备单组分干扰素成为可能。

1980年和1982年利用基因工程成功的获得IFN-αIFN-β，和IFN-γ的cDNA，标志着第二代干扰素的诞生。

1987年，三种干扰素开始

大量工业化生产，并进入市场。第68页,共96页，2024年2月25日，星期天

干扰素的基因文库的构建一般是用诱导剂对可以产生干扰素的肿瘤细胞菌株进行诱导，从中取出mRNA，克隆及基因文库的构建

通过相应的引物对干扰素的mRNA进行逆转录-PCR扩增，将其与一定的质粒相连接后用合适的宿主菌株进行培养，扩增即可。

以从Namalva细胞中克隆IFN-αIFN-β为例。第69页,共96页，2024年2月25日，星期天异硫氰酸胍（GITC）—酚法提取RNA的原理如下：

GITC（蛋白质变性剂）与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase(RNA水解酶)的活性；

GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。

将Namalva细胞用Senda病毒诱导后，用酚法提取mRNA

许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。第70页,共96页，2024年2月25日，星期天

分离的总RNA可利用mRNA3‘末端含有多聚(A)+的特点,当RNA流经oligo(dU)纤维素柱（U重复寡核苷酸就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链）时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dU)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。经过两次oligo(dU)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。---属于亲和层析技术。

因为OligodU与mRNA的PolyA尾巴可以发生特异性结合，利用二者的亲和力可以分离mRNA。第71页,共96页，2024年2月25日，星期天流经oligo(dU)纤维素柱纯化及5%-20%(W/V)蔗糖密度梯度离心25000rpm，20hr后取6-18s的组分。用逆转录酶合成cDNA后，用DNA聚合酶合成DNA。用核酸酶S1切成平头末端后，用5%-20%(W/V)蔗糖密度梯度离心进行纯化，取大于600bp的组分。合成引物5’-CCTTCTGGAACTG-3’,该序列是IFN-αIFN-β最长的不间断保守序列，用其作引物克同时钓出IFN-αIFN-β。在T4激酶的作用下，用γ-32P-ATP对其进行标记，并用SephadexG-25进行纯化，可是得到标记后的cDNA。第72页,共96页，2024年2月25日，星期天将0.5μg平头末端DNA用末端转移酶加上15个dC，并将2μg质粒pBB322在PstІ位点线性化，用末端转移酶接上15个dG，在将两则相连接，利用这种方法可产生PstІ位点，利于从载体上再次切下cDNA。将产生的质粒转化大肠杆菌HB101后，用微量板培养。微量板培养第73页,共96页，2024年2月25日，星期天

将微量板上的菌落转移到纤维膜上，但菌落直径长到2mm后，与事先分离的末端标记的cDNA37℃杂交2d。然后用50%甲酰胺，0.2×SSC（1×SSC为0.15mol/LNaCl,0.15mol/L柠檬酸钠）室温下洗膜3hr。

在上述杂交液中加入50μg/mlpoly(U),10μg/mlpoly(I):poly(C)进行杂交，用50%甲酰胺，1×SSC洗脱后在室温干燥，并于-70℃曝光，检测细胞中质粒与cDNA杂交情况。第74页,共96页，2024年2月25日，星期天备注：

沉降系数（sedimentationcoefficient）用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。

或s=v/ω^2‧r。s是沉降系数，ω是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。

沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为1～200×10的-13次方秒范围，10的-13次方这个因子叫做沉降单位s，即1s=10^-13秒，如血红蛋白的沉降系数约为4×10的-13次方秒或4s。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4s和40s之间，核糖体及其亚基在30s和80s之间，多核糖体在100s以上。第75页,共96页，2024年2月25日，星期天

目前我国临床上使用的干扰素品种有IFN-αⅠb，IFN-αⅠa，IFN-αⅡb等，其中多以大肠杆菌为宿主菌，只有IFN-αⅡa采用酵母作为宿主菌。下面以IFN-αⅡb为例，介绍干扰素生产工艺过程。基因工程菌生产干扰素工艺1、干扰素IFN-αⅡb基因工程菌的构建

IFN-αⅡb是我国开发成功进行产业化生产的第一个干扰素品种，也是我国第一个基因工程药物品种，有长春生物制品研究所研究开发。第76页,共96页，2024年2月25日，星期天诱生的白细胞或成纤维细胞提取全RNA通过寡dU-纤维素柱获得聚A的mRNA5%~23%蔗糖密度梯度离心提取12SmRNA自mRNA逆转录合成cDNA双链cDNA用末端DNA转移酶接上dT或dG尾PBR322质粒DNA的PstI酶切割段加上dA或dC退火获得杂交质粒扩增杂交质粒筛选抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌克隆采用杂交翻译法挑选含有干扰素cDNA的克隆

将干扰素cDNA的克隆入表达载体在大肠杆菌中高效表达PstI酶：内切酶识别序列CTGCA^G

G^ACGTC第77页,共96页，2024年2月25日，星期天

抗生素平板筛选（插入失活）第78页,共96页，2024年2月25日，星期天2.基因工程干扰素的生产工艺IFN工程菌

纯化提取斜面摇瓶发酵第79页,共96页，2024年2月25日，星期天(1)发酵包括种子培养和发酵1、生产种子：人干扰素IFN-αⅡb的生产菌种用的是以大肠杆菌为宿主菌的基因工程菌。一般用温度敏感型启动子调控IFN-αⅡb的表达。2、种子培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物、0.5%NaCl，pH7.0，121℃，灭菌15min。3、种子摇瓶培养：在4个1L三角瓶中，分别装入250mL种子培养基，按要求灭菌后，分别接种IFN-αⅡb的生产菌种，30℃摇床培养10hr，作为发酵罐种子使用。第80页,共96页，2024年2月25日，星期天4、发酵培养基：

1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物、0.01%NH4Cl、0.05%NaCl、0.6%Na2HPO4、0.001%CaCl2、0.3%KH2PO4、0.01%MgSO4、0.4%葡萄糖、0.05%氨苄西林、少量消泡剂。5、发酵：

用15L发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为10L，pH6.8，搅拌转速500r/min，通风比为1：1m3/(m3.min),

溶氧为50%。控制温度30℃发酵培养8hr。

在该时间内，温度敏感型启动子受cI蛋白抑制而被关闭。待菌体量充足后，提高发酵温度至42℃，诱导启动子开启，启动干扰素基因的转录和翻译，合成干扰素产物。诱导时间大约3hr，即可完成发酵。第81页,共96页，2024年2月25日，星期天（2）产物的提取和纯化1、提取：干扰素发酵发酵结束后，冷却，离心（4000r/min）30min,除去上清液，收集湿菌体，约1000g。将上述湿菌体重新悬浮于5L20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）中，于冰浴条件下进行超声波破碎。

由于大肠杆菌中不含真核细胞中所具有的一些帮助蛋白质折叠的细胞因子，因此合成的干扰素IFN-αⅡb以包涵体形式存在。

大肠杆菌细胞质中的包涵体直径一般在0.2到1.5μm之间，不同的蛋白质具有不同的直径，如干扰素的大小是0.811μm。

所有的包涵体密度较大，是微生物细胞中密度最大的结构，密度在1.1-1.3之间，

第82页,共96页，2024年2月25日，星期天

包涵体是水不溶性的，细胞破碎后释放出来的包涵体可用离心方法分离。离心条件为（4000r/min）30min，去沉淀部分，用1L含8mol/L尿素、20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）、0.5mmol/L二巯基苏糖醇溶液，室温搅拌2hr，使包涵体溶解。

在溶解过程中，干扰素IFN-αⅡb包涵体的肽链会局部打开后重新折叠，形成正确的有生物活性的干扰素IFN-αⅡb空间构象。第83页,共96页，2024年2月25日，星期天

溶解后，再15000r/min离心30min，去除不溶物（其中主要是细胞碎片），收集含有干扰素IFN-αⅡb的上清液，用20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）稀释至尿素浓度为0.5mol/L，加二巯基苏糖醇至1.0mmol/L，4℃搅拌15hr，15000r/min离心30min，除去不溶物。

上清液经过截留量为104相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的干扰素IFN-αⅡb溶液经过葡萄糖凝胶柱（SephadexG-50）分离。上柱前，层析柱（2cm×100cm）先用20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）平衡。上柱后，用同一缓冲液洗脱分离，收集干扰素IFN-αⅡb部分。第84页,共96页，2024年2月25日，星期天2、纯化：将收集的干扰素IFN-αⅡb再经过离子交换纤维柱（DE-52）纯化，干扰素上柱后用含0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/LNaCl的20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）分别洗涤，收集含干扰素IFN-αⅡb的洗脱液。

全过程蛋白质回收率20%~25%，产品不含杂蛋白、DNA及热原质，符合质量标准。第85页,共96页，2024年2月25日，星期天三、白细胞介素(一)特性、结构和功能

白细胞介素（interleukin,简称IL）具有介导白细胞间相互作用的功能，除此，部分参与其他细胞的相互作用，如造血干细胞、血管内皮细胞、纤维母细胞、神经细胞、成骨细胞和破骨细胞等，属于淋巴因子家族的一员。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用.

目前发现的白细胞介素29种，按发现的先后，依次称为IL-1~29.国内批准上市的并在临床上应用的有IL-2，IL-6，IL-12三种。其中IL-2是最早批准上市的白细胞介素品种。第86页,共96页，2024年2月25日，星期天白细胞介素-2（IL-2）

由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名，现仍一直沿用。

白细胞介素-2是由活化的淋巴细胞所产生的，含有133个氨基酸、分子量为14500的糖蛋白，糖蛋白有一个链内二硫桥（58位，105位），它刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖。IL-2在pH2~9范围稳定，等电点为pH6.5，56℃加热1hr还有活性，但65℃加热30min即失去活性。对各种蛋白酶敏感，对核酸酶不敏感。

IL-2

(又称T细胞生长因子,TCGF)第87页,共96页，2024年2月25日，星期天主要生物学功能

（1）活化T细胞，促进细胞因子产生；（2）刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；(LAK:淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokineactivatedkillercells,）（3）促进B细胞增殖和分泌抗体；（4）激活巨噬细胞。作用方式:

以自分泌和旁分泌方式发挥效应。

第88页,共96页，2024年2月25日，星期天工艺流程图示取上清液，加入饱和硫酸铵溶液至0.35饱和度，4℃静置24小时，离心，弃去沉淀。用鸡瘟病毒和丝裂原培养液联合刺激人外周血白细胞，37℃，CO2培养箱培养，形成诱生白细胞培养液。