浙江大学生物化学甲实验实验酶的基本性质实验底物专一性激活剂和抑制剂最适温度省公开课一等奖全国示范课微

试验七

用正交法测定几个原因对蔗糖酶活性影响丁鸣（半自主性设计试验）第1页一、试验目标和要求

1.初步掌握正交试验设计法使用。2.利用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH值这四种原因对酶活力影响。二、试验基本原理酶催化作用是在一定条件下进行，它受各种原因影响，如酶浓度、底物浓度、温度、pH值、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化反应速度。通常在其它原因恒定条件下，经过某一原因在一系列改变条件下酶活性测定求得该原因影响，这是单原因试验方法。对于多原因试验能够经过正交试验设计法来完成。正交法是借助于正交表，简化表格计算，正确分析结果，找到试验最正确条件，分清原因主次，这么就能够经过比较少试验次数到达好试验效果。实践证实正交法是一个多、快、好、省方法。当前已广泛用于工农业生产和科学试验中。本试验利用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH值这四个原因对酶活性影响，并求得在什么样底物浓度、酶浓度、温度和pH值时酶活性最大。第2页三、试验材料与试剂1、试验材料纯化蔗糖酶（样品Ⅳ）2、试验试剂⑴5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）；⑵0.2mol/L乙酸缓冲液，pH3.6、4.6、5.6；⑶3,5－二硝基水杨酸试剂；甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。四、试验器材与仪器1.试管及试管架；2.吸量管；3.恒温水浴箱（37℃、50℃、65℃、100℃）；4．可见光分光光度计。第3页五、试验操作方法和步骤1、试验设计⑴、确定试验原因和水平本试验取四个原因，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH值。每个因素选三个水平，试验原因和选取水平如表1。表1原因、水平表原因水平[S]（ml）[E]（ml）温度（℃）pH10.51.0503.620.20.6375.630.80.2654.6

作原因、水平表时，各原因水平，最好不要按大小次序排列。按普通方法，如对四个原因三个水平各种搭配都要考虑，共需做34=81次试验，而用正交表只需做9次试验。第4页⑵、选择适当正交表

适当正交表，是指要考查原因自由度总和，应该小于所选正交表总自由度。正交表Ln（tq）L——正交表代号n——处理数（试验次数）t——水平数q——原因数试验次数n=q(t–1)+1=4（3－1）+1＝9总自由度V总=n-1各列自由度V列=K（该列水平数）–1比如本试验选取四个原因，每个原因选三个水平，四个原因各占一列，那么四个原因自由度分别为：V1=3–1=2，V2=3–1=2，V3=3–1=2，V4=3–1=2。四个原因自由度总和=V1+V2+V3+V4=8因为各原因自由度总和是8，它没有超出L9（34）总自由度=9–1=8。所以选择正交表L9（34）是适合。第5页3.在所选正交表上进行表头设计因为本试验是一项四原因各三水平试验，这么将四个原因依次放在L9（34）第1，2，3，4列上，这项把原因放入正交表头工作，叫做表头设计。见表2。正交表都应含有以下两个特征：（1）在每一列中，各水平出现次数相等。即在任何一列中，数字1和数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）。（2）任何两列中，横行组成数对出现次数相等，均出现一次（这里有9个不一样数对，均出现一次）（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出现一次。以上这些特点确保了用正交表安排试验计划是均衡搭配，所以分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。在所选正交表上进行表头设计，见表2。

第6页水平原因试验号1[S]2[E]3温度4pH111112122231333421235223162312731328321393321L9表表2表头设计第7页2、试验安排将本试验四个原因依次填入L9表原因1，2，3，4中；再将各列水平数用该列原因对应水平写出来，便可得到下面试验安排表（表3）。表中试验号共9个，表示要做9次试验，每次试验条件如每一纵行所表示。如做第一个试验时[S]是0.5ml，[E]是1.0mL，温度50℃，pH为3.6。第二个试验[S]是0.5ml，[E]是0.6mL，温度37℃，pH为5.6，余类推。第8页试验号试剂（ml）2491683575%蔗糖溶液[S]0.50.20.80.50.20.80.50.20.80.2mol/L乙酸缓冲溶液[pH]pH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0蒸馏水0.90.81.00.51.60.61.31.20.237℃预温5min50℃预温5min65℃预温5min蔗糖酶（样品Ⅳ）[E](作对应预温）0.61.00.21.00.20.60.20.61.0[温度]37℃反应10min50℃反应10min65℃反应10minDNS111111111100℃×5min蒸馏水555555555A520表3试验安排表

另取试管一支作非酶对照，即加5%蔗糖溶液0.5ml，缓冲液1.9ml。先加DNS1ml摇匀室温放置5分钟后再加入蔗糖酶（样品Ⅳ）0.6ml摇匀室温放置10分钟，100℃×5min，再加入蒸馏水5ml，混匀后在520nm处测光密度值。第9页六、试验结果及分析试验做好后，把9个数据填入表4试验结果栏内，按表中数据计算出各原因一水平试验结果总和、二水平试验结果总和、三水平试验结果总和，再取平均值（各自被3除）。最终计算极差。极差是指这一列中最好与最坏之差，从极差大小就能够看出那个原因对酶活力影响最大，那个影响最小。找出任何条件下酶活力最高。最终作一直观分析结论。以OD值为纵座标，原因水平数为横座标作图。试验经典结果与异常分析

试验确定最正确条件与理论很吻合。如出现与理论显著不一致现象可能是试验过程中如加样及时间控制等出现较大误差所致。第10页水平原因试验号1[S](ml)2[E](ml)3温度(℃)4pH值试验结果A520110.511.015013.6210.520.623725.6310.530.236534.6420.211.023734.6520.220.636513.6620.230.215025.6730.811.036525.6830.820.615034.6930.830.223713.6Ⅰ(一水平试验结果总和)Ⅱ(二水平试验结果总和)Ⅲ(三水平试验结果总和)Ⅰ/3Ⅱ/3Ⅲ/3级差表4试验结果分析计算表第11页七、注意事项

1、各试剂加样一定要准确。2、保温时间各管