氨基酸的代谢控制与发酵

关于氨基酸的代谢控制与发酵大约20种氨基酸构成了数目庞大的各种肽类和蛋白质。其中8种氨基酸是人体必需的，它们分别是L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸。第一节概述第2页,共123页，2024年2月25日，星期天一、氨基酸的应用与市场

氨基酸的应用是基于它们的营养价值、风味、生理活性和化学特性。主要应用领域是食品、饲料、化妆品、医药，也用作化学工业的中间体。据估计全世界每年氨基酸市场为40－50亿美元，其中35%用于食品、50%用于饲料和15%用于医药和化妆品。第3页,共123页，2024年2月25日，星期天1、食品领域氨基酸大多无味，但它们是自然芳香的前体。谷氨酸钠（味精）是所有氨基酸中最大生产品种，全世界年产量达100万吨（中国大陆约为60万吨）。二肽和寡肽大多具有苦味，但二肽L-门冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（Aspartame，阿斯巴甜）是个例外，它比蔗糖甜150－200倍，现已广泛作为人造甜味剂，应用于低热量的饮料等。目前，阿斯巴甜的世界年产量已超过2万吨。

第4页,共123页，2024年2月25日，星期天2、饲料领域

组成蛋白质的氨基酸几乎半数对于动物（如猪和家禽）来说是必需的。蛋氨酸和赖氨酸的全世界年产量分别为35万吨和40万吨。近年来，由于发酵水平的提高，苏氨酸成功地进入饲料市场，估计全世界年产量已达1.5万吨。L-色氨酸也是一种限制性氨基酸，尤其在以玉米为基础的饲料中。但由于生产成本较高，目前L-色氨酸的世界年产量仅500吨（日本400吨），因此还不能广泛作为饲料添加剂使用。

第5页,共123页，2024年2月25日，星期天3、医药领域

L-氨基酸输液是术前和术后的营养治疗剂。标准氨基酸输液含有8种必需氨基酸，2种半必需氨基酸（L-精氨酸和L-组氨酸），以及几种非必需氨基酸，通常包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-谷氨酸。L-门冬氨酸钾镁常用于消除疲劳和治疗心力衰竭和肝脏疾病。第6页,共123页，2024年2月25日，星期天4、工业领域

谷氨酸制成的聚谷氨酸树脂具有天然皮革性能，因此可用于制造人造皮革和涂料。谷氨酸还可以制造人造纤维。甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸等可用于制造表面活性剂、缓冲剂和抗氧化剂。

第7页,共123页，2024年2月25日，星期天生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸，可直接用于输液制剂的生产。日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家，生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司，湖北八峰氨基酸公司，但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。2000年后，世界氨基酸产值已达45亿美元，占生物技术市场的7%；国内的氨基酸产值可达40亿元，占全国发酵产业总产值的12%。第8页,共123页，2024年2月25日，星期天二、氨基酸的生产方法

蛋白质水解法：早期味精生产、复合氨基酸化学合成法：DL-蛋氨酸，甘氨酸，DL-丙氨酸微生物发酵法

1956年，木下竹郎（Kinoshita）首次报道分离出谷氨酸产生菌；次年发酵法工业化生产谷氨酸首先在日本问世，继而迅速掀起一股氨基酸发酵研究的热潮。经过半个世纪的努力，目前几乎所有氨基酸都能用微生物法生产（胱氨酸和半胱氨酸除外）。第9页,共123页，2024年2月25日，星期天氨基酸发酵属于典型的代谢控制发酵，这是由于氨基酸的生物合成受到严格的反馈调节。要进行氨基酸发酵，就必须采取某些人为的手段以打破微生物的反馈调节机制，从而大量积累目的氨基酸。第10页,共123页，2024年2月25日，星期天采用微生物法生产氨基酸的情况如下：1）使用野生型细菌生产氨基酸（L-谷氨酸、L-丙氨酸等）；2）使用突变株生产氨基酸（L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、L-高丝氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸等）；3）使用添加前体的方法生产氨基酸（如用邻氨基苯甲酸生产L-色氨酸；甘氨酸生产L-丝氨酸等）；第11页,共123页，2024年2月25日，星期天4）使用酶法生产氨基酸（利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸，如以延胡索酸和铵盐为原料，经天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨酸）；5）应用基因工程、蛋白质工程和代谢工程方法育成的菌株，进行发酵生产（L-羟脯氨酸）。第12页,共123页，2024年2月25日，星期天

氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较大的差异，但是许多氨基酸的合成途径在不同生物体中也有共同之处。按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：㈠谷氨酸族（α-酮戊二酸族）包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸；㈡丙酮酸族包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；

第13页,共123页，2024年2月25日，星期天㈢天冬氨酸族（草酰乙酸族）包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；㈣磷酸甘油酸族包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；㈤芳香族包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。第14页,共123页，2024年2月25日，星期天第二节谷氨酸发酵的代谢控制育种

1957年日本率先采用微生物发酵法生产谷氨酸，被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进行代谢控制发酵的阶段。目前全国有近50家工厂生产味精，年产量约为60万吨，居世界首位。

第15页,共123页，2024年2月25日，星期天一、谷氨酸的生物合成与发酵生产

㈠谷氨酸生物合成途径（1）糖酵解途径（EMP）（2）磷酸已糖途径（HMP)（3）三羧酸循环(TCA)（4）乙醛酸循环（DCA）（5）二氧化碳固定反应（6）α-KGA的还原氨基化反应第16页,共123页，2024年2月25日，星期天第17页,共123页，2024年2月25日，星期天①苹果酸酶②丙酮酸羧化酶③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶CO2固定反应(丙酮酸羧化支路)第18页,共123页，2024年2月25日，星期天㈡谷氨酸glutamicacid合成的内在因素GA产生菌必须具备以下条件α-酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺失TCA环阻断，α-酮戊二酸积累琥珀酸辅酶ATCA环正常

GA产生菌体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失积累NADPH，抑制α—KGA的脱羧氧化

GA产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶通过该酶酶活性调节实现DCA循环的封闭，GA积累第19页,共123页，2024年2月25日，星期天

菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性提供NADPH,用于还原α-酮戊二酸生成谷氨酸氨的导入合成谷氨酸的反应有3种：α-酮戊二酸+NH4++NADPH谷氨酸脱氢酶GDHα-酮戊二酸+谷氨酰胺+NADPH谷氨酸转氨酶AT谷氨酸α-酮戊二酸+α-酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶GS谷氨酸H2ONADP++反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联

第20页,共123页，2024年2月25日，星期天㈢谷氨酸生物合成的理想途径此时，谷氨酸对糖的转化率达到81.7%；目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内。第21页,共123页，2024年2月25日，星期天㈣生物素（VH）对谷氨酸发酵的影响1、生物素对糖代谢的影响生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度(对TCA有促进作用）而丙酮酸氧化脱羧的速度未改变丙酮酸积累乳酸积累碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。第22页,共123页，2024年2月25日，星期天研究表明，异柠檬酸裂解酶活性

为醋酸诱导

受琥珀酸的阻遏抑制当VH缺乏时：（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱，乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；两者综合的作用使得异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。另一方面，可以通过控制VH的浓度，实现对于乙醛酸循环的封闭。第23页,共123页，2024年2月25日，星期天

生物素对糖代谢的影响：主要是影响糖降解速度，而不是影响EMP与HMP途径的比率。在生物素充足的条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也得到提高，但由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出。

生物素对CO2固定反应也有影响。研究表明，生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定反应。据有关资料报道，当生物素过量（100μg/L以上）时，CO2固定反应可提高30%。第24页,共123页，2024年2月25日，星期天以葡萄糖为原料发酵生成谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。另外，该酶受琥珀酸阻遏，生物素亚适量时因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向高效率地移动。第25页,共123页，2024年2月25日，星期天2、生物素对氮代谢的影响VH丰富时，出现“只长菌，不产酸”的现象谷氨酸发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。

控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸或参与蛋白质合成。第26页,共123页，2024年2月25日，星期天

在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白质。在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。第27页,共123页，2024年2月25日，星期天3、生物素对菌体细胞膜通透性的影响

通常谷氨酸发酵采用的菌种都是生物素缺陷型，而生物素又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制生物素的浓度（干扰磷脂中的脂肪酸的生物合成）来实现对菌体细胞膜通透性的调节。

培养基中生物素限量时，胞内AA92%胞外培养基中生物素丰富时，胞内AA12%胞外

第28页,共123页，2024年2月25日，星期天

谷氨酸生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失调使Glu得以积累。

生物素贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易析出，而培养基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不积累Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。这说明生物素对细胞膜通透性有重要影响。第29页,共123页，2024年2月25日，星期天细胞膜透性的调节谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能发生特异性变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的形态，使终产物不断排出细胞外，胞内谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，胞内谷氨酸源源不断被优先合成，分泌到发酵培养基中积累。细胞透性的调节，一般通过向培养基中添加化学成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性剂、青霉素等，达到抑制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常生理状态，解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。第30页,共123页，2024年2月25日，星期天生物素：影响磷脂的合成及细胞膜的完整性。油酸：直接影响磷脂的合成及细胞膜甘油：甘油缺陷型菌株丧失α-磷酸甘油脱氢酶，不能合成α-磷酸甘油和磷脂。限量供应甘油，控制了细胞膜中与渗透性直接关系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而积累。表面活性剂：对生物素有拮抗作用，拮抗不饱和脂肪酸的合成，导致磷脂合成不足，影响细胞膜的完整性，提供细胞膜对谷氨酸的渗透性。青霉素：抑制细菌细胞壁的后期合成，形成不完整的细胞壁，使细胞膜失去保护，使胞内外的渗透压差导致细胞膜的物理损伤，增大谷氨酸向胞外漏出的渗透性。第31页,共123页，2024年2月25日，星期天生物素阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成表面活性剂对生物素有拮抗阻断脂肪酸的合成影响细胞膜的合成在对数生长期添加青霉素抑制细胞壁合成细胞膜损伤甘油缺陷型磷脂的合成受阻影响细胞膜的合成油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成影响细胞膜的合成提高细胞膜的谷氨酸通透性控制磷脂的合成使细胞膜受损（如表面活性剂）青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜控制磷脂含量通过油酸的合成通过甘油合成直接控制磷脂合成第32页,共123页，2024年2月25日，星期天二、谷氨酸生物合成的调节机制第33页,共123页，2024年2月25日，星期天㈠谷氨酸生物合成的调节①谷氨酸脱氢酶②

-酮戊二酸脱氢酶③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶④柠檬酸合成酶第34页,共123页，2024年2月25日，星期天⑴优先合成

在微生物的代谢中，Glu比Asp优先合成；合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp；

Asp过量时反馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。

⑵谷氨酸脱氢酶(GDH)的调节谷氨酸脱氢酶谷氨酸对其反馈抑制和反馈阻遏⑶柠檬酸合成酶的调节柠檬酸合成酶TCA的关键酶，受能荷调节，谷氨酸反馈阻遏，乌头酸反馈抑制所以，正常代谢不积累Glu第35页,共123页，2024年2月25日，星期天⑷异柠檬酸脱氢酶的调节

细胞内α-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当α-酮戊二酸过量时，将对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成α-酮戊二酸。异柠檬酸脱氢酶α-酮戊二酸反馈抑制⑸α-酮戊二酸脱氢酶:谷氨酸产生菌中先天性的丧失或微弱。⑹磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEP受天冬氨酸反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸反馈阻遏。第36页,共123页，2024年2月25日，星期天37丧失或有微弱的

-酮戊二酸脱氢酶活力，使-酮戊二酸不能继续氧化；CO2固定能力强，使四碳二羧酸全部由CO2固定反应提供，而不走乙醛酸循环；谷氨酸脱氢酶的活力很强，并丧失谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制和反馈阻遏，同时，NADPH2再氧化能力弱，使-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻；有过量的NH4+存在，-酮戊二酸经氧化还原共轭氨基化反应而生成谷氨酸却不形成蛋白质，从而分泌泄漏于菌体外；同时，谷氨酸生产菌应不利用体外的谷氨酸，使谷氨酸成为最终产物。生产菌株还应该具有生物素合成缺陷、油酸合成缺陷和甘油合成缺陷等特点。㈡谷氨酸高产菌模型特征第37页,共123页，2024年2月25日，星期天1、谷氨酸生产菌的育种思路

㈢谷氨酸生产的代谢调控第38页,共123页，2024年2月25日，星期天1.切断或减弱支路代谢

2.解除自身的反馈抑制

3.增加前体物的合成

4.提高细胞膜的渗透性

5.强化能量代谢6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株

育种思路：第39页,共123页，2024年2月25日，星期天1.切断或减弱支路代谢

⑴选育减弱α-酮戊二酸进一步氧化能力的突变株

减弱α-酮戊二酸脱氢酶复合体的活性，可以使代谢流向谷氨酸，从而使谷氨酸得到积累。

⑵选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株

通过HMP途径也可生成核糖、核苷酸、辅酶Q、维生素K、叶酸等物质。这些物质的生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的产率降低。如果削弱或切断这些物质的合成途径，就会使谷氨酸的产率增加。这可通过选育莽草酸缺陷型或添加芳香族氨基酸能促进生长的突变株以及抗嘌呤、嘧啶类似物或核苷酸类抗生素来实现。第40页,共123页，2024年2月25日，星期天⑶选育不分解利用谷氨酸的突变株

可通过选育以谷氨酸为唯一碳源，菌体不长或生长微弱的突变株来实现。⑷选育减弱乙醛酸循环的突变株

四碳二羧酸是由CO2固定反应和乙醛酸循环所提供的。减弱乙醛酸循环，CO2固定反应所占的比例就会增大，谷氨酸的产率就高。这可通过选育琥珀酸敏感型突变株、不分解利用乙酸突变株、异柠檬酸裂解酶活力降低菌株来实现。⑸阻止谷氨酸进一步代谢

由于细胞还可以谷氨酸为前体继续向下合成谷氨酰胺等，要避免谷氨酸被菌体利用，还需要切断谷氨酸向下的代谢途径。第41页,共123页，2024年2月25日，星期天2.解除菌体自身的反馈调节

⑴选育耐高渗透压突变株

要使菌种能高产谷氨酸，首先要使菌种具备在高糖、高谷氨酸的培养基中仍能正常生长、代谢的能力。这可通过选育耐高糖、耐高谷氨酸及耐高糖+高谷氨酸突变株来实现。

⑵选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株

当谷氨酸合成达到一定量时，谷氨酸就会反馈抑制和阻遏谷氨酸脱氢酶，使谷氨酸的合成停止，使代谢转向天冬氨酸的合成，因此要解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈调节。这可通过选育酮基丙二酸抗性、谷氨酸结构类似物抗性（如谷氨酸氧肟酸盐）、谷氨酰胺抗性突变株来实现。

第42页,共123页，2024年2月25日，星期天3.增加前体物的合成

⑴选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到α-酮戊二酸代谢的突变株

这可通过选育柠檬酸合成酶活力强突变株及抗氟乙酸、氟化钠、重氮丝氨酸、氟柠檬酸等突变株来实现。

⑵选育强化CO2固定反应的突变株

这可通过选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源生长良好的突变株、氟丙酮酸敏感突变株以及丙酮酸或天冬氨酸缺陷突变株来实现。

第43页,共123页，2024年2月25日，星期天4.提高细胞膜的渗透性

（1）选育抗Vp类衍生物突变株

选育抗Vp类衍生物，如香豆素、卢丁等突变株，都能遗传性的改变细胞膜的渗透性。生物素缺陷株（生物素亚适量）（2）选育溶菌酶敏感突变株

使细胞壁网状结构变疏松，对细胞膜保护作用降低，渗透性变大。（3）选育二氨基庚二酸缺陷突变株

第44页,共123页，2024年2月25日，星期天5.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株2000年，莲花集团技术中心与河南省科学院生物研究所共同承担河南省重大科技攻关项目“FM00-187谷氨酸高产酸菌种选育”，利用原生质融合这一基因重组技术，将两个具有不同基因型的细胞进行融合，达到基因重组的目的，获得高产酸的谷氨酸菌株，谷氨酸产酸率由10.5%提高到14%以上，糖酸转化率提高到65%以上。第45页,共123页，2024年2月25日，星期天1、生产菌种现在经过鉴定和命名的谷氨酸生产菌很多，主要是棒杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。它们有很多相似点：革兰氏阳性；不形成芽孢；没有鞭毛，不能运动；都需要生物素作为生长因子；都具有一定的过量合成谷氨酸能力。目前国内大多数厂家使用的菌种是天津工业微生物研究所选育的天津短杆菌T6-13及其变异株。三、谷氨酸的生产工艺第46页,共123页，2024年2月25日，星期天2、谷氨酸发酵生产发酵初期（适应期），糖基本没有利用，尿素分解放出氨使pH值略上升。延滞期的长短一般为2-4h。进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，尿素大量分解，pH值很快上升。但随着氨被利用pH值又下降，溶氧浓度急剧下降，然后又维持一定水平，菌体浓度迅速增大。这个时期，为了及时供给菌体生长必需的氮源及调节培养液的pH值至7.5-7.8，必须流加尿素；又由于代谢旺盛，泡沫增加并放出大量发酵热，需加入消泡剂及冷却，使温度维持在30-32℃。这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。

第47页,共123页，2024年2月25日，星期天当菌体生长基本停止就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α-酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段，为了提供谷氨酸合成所需的氨及维持pH值在7.0-7.2，必须流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需要加大通气量，并将发酵温度提高到谷氨酸合成的最适温度36-37℃。发酵后期，菌体衰老，糖耗缓慢，残糖低，此时流加尿素必须相应减少。当营养物质耗尽酸度不再增加时需及时放罐。发酵周期一般为30-36h。

第48页,共123页，2024年2月25日，星期天第三节

天冬氨酸族氨基酸发酵机制第49页,共123页，2024年2月25日，星期天一、生物合成途径及代谢调控机制㈠、生物合成途径

天冬氨酸族氨基酸合成可以以草酰乙酸或天冬氨酸为原料，合成苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和赖氨酸。第50页,共123页，2024年2月25日，星期天葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸天冬氨酸β-半醛

赖氨酸高丝氨酸蛋氨酸

苏氨酸

异亮氨酸EMPCO2固定、氧化氨基化反应天冬氨酸激酶天冬氨酸β-半醛脱氢酶二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶高丝氨酸脱氢酶琥珀酰高丝氨酸合成酶高丝氨酸激酶苏氨酸脱氨酶第51页,共123页，2024年2月25日，星期天第52页,共123页，2024年2月25日，星期天第53页,共123页，2024年2月25日，星期天㈡、天冬氨酸族生物合成的代谢调节机制在细菌中，虽然天冬氨酸族氨基酸生物合成途径是相同的，但是其代谢调节机制是多种多样的。

1.大肠杆菌K12①天冬氨酸激酶（AK）

AKⅠ:受苏氨酸、异亮氨酸的多价抑制和阻遏

AKⅡ：受蛋氨酸专一性抑制和阻遏

AKⅢ：受赖氨酸专一性抑制和阻遏第54页,共123页，2024年2月25日，星期天②天冬氨酸-β-半醛脱氢酶专一性的受赖氨酸不完全的抑制③二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶（赖氨酸分支的第一个酶）

DDP合成酶受赖氨酸反馈抑制。二氨基庚二酸（DAP）脱羧酶受赖氨酸阻遏第55页,共123页，2024年2月25日，星期天④高丝氨酸脱氢酶（HD）（通向苏氨酸、蛋氨酸分支的第一个酶）

HDⅠ：受苏氨酸反馈抑制

HDⅡ：受蛋氨酸阻遏⑤苏氨酸脱氨酶（异亮氨酸合成途径的酶）受异亮氨酸的反馈抑制和阻遏第56页,共123页，2024年2月25日，星期天第57页,共123页，2024年2月25日，星期天2.黄色短杆菌其赖氨酸生物合成调节机制比大肠杆菌简单，其天冬氨酸激酶只有一种，该酶具有两个变构部位，可以与终产物结合，当只有一种终产物（赖氨酸或苏氨酸）与酶结合，酶活性不受影响。当两种终产物（赖氨酸和苏氨酸）同时过量时，与酶的两个变构部位结合，该酶活性受到抑制，这种终产物的反馈抑制称为协同反馈抑制。第58页,共123页，2024年2月25日，星期天第59页,共123页，2024年2月25日，星期天3.乳糖发酵短杆菌赖氨酸合成调节1）存在代谢优先向苏氨酸和蛋氨酸方向进行。2）与黄色短杆菌区别：AK受赖氨酸+苏氨酸的反馈抑制存在代谢互锁，DDP合成酶的合成受亮氨酸阻遏，DDP还原酶受半胱氨酸和丙氨酸抑制。第60页,共123页，2024年2月25日，星期天第61页,共123页，2024年2月25日，星期天黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌，其赖氨酸生物合成调节机制比大肠杆菌简单得多。这些细菌只有一种AK，不存在想大肠杆菌那样的三种同功酶。反馈调节易于解除，使育种过程简单化，故常被用作氨基酸发酵育种的出发菌株。第62页,共123页，2024年2月25日，星期天

谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等中的天冬氨酸族氨基酸的代谢调节机制包括以下几方面：⑴关键酶AK是关键酶，受Lys和Thr的协同反馈抑制。⑵优先合成Met比Thr、Lys优先合成，Thr比Lys优先合成。⑶代谢互锁在乳糖发酵短杆菌中，Lys分支途径的初始酶DDP合成酶受Leu的反馈阻遏。⑷平衡合成Asp和乙酰CoA形成平衡合成。当乙酰CoA合成过量时，能解除Asp对PEP羧化酶的反馈抑制。⑸Asp与Glu之间的调节机制Glu比Asp优先合成。当Glu合成过量时，反馈抑制GHD，使生物合成转向Asp。当Asp合成过量时，反馈抑制PEP羧化酶，使整个生物合成停止。第63页,共123页，2024年2月25日，星期天第64页,共123页，2024年2月25日，星期天二、赖氨酸发酵

L-赖氨酸的化学名称为2,6-二氨基己酸，分子式C6H14O2N2。作为第一限制性必需氨基酸，广泛应用于食品、饲料和医药工业，在平衡氨基酸组成方面起着十分重要的作用。目前绝大部分赖氨酸都是采用发酵法生产。第65页,共123页，2024年2月25日，星期天

赖氨酸是一种必需氨基酸，可以促进儿童发育，增强体质。补充适量L-赖氨酸，可以大大提高蛋白质的利用率。赖氨酸被广泛用于食品强化剂、饲料添加剂及医疗保健、滋补饮料等各方面，是一个具有广泛市场的氨基酸产品。目前全世界产量已达20万吨，而且还呈上升趋势，其中日本占世界产量的60%，我国赖氨酸生产水平还有待提高。第66页,共123页，2024年2月25日，星期天公司厂址规模(万吨/年)制法味之素日本，九州佐贺县2.0发酵法协和发酵日本，山口县防府1.5发酵法哈特兰德赖氨酸公司美国，依阿华州2.0发酵法生物协和发酵美国，蜜苏里州开普吉拉多1.36发酵法ADM公司美国，依利诺斯州迪凯特4.7发酵法亚吉诺莫托公司美国，北卡罗来纳州罗利不详发酵法欧洲赖氨酸公司法国，亚眠2.0发酵法日本味之素泰国公司泰国，曼谷0.2发酵法东丽公司日本，名古屋0.8酶法费埃尔麦克斯墨西哥0.6发酵法协和与匈联营公司匈牙利，布达佩斯东0.5发酵法塔拉戈纳化工公司西班牙，巴伦西亚得塘湖安0.6发酵法台湾糖业公司台南市0.4发酵法合计21.58表世界主要赖氨酸生产厂家第67页,共123页，2024年2月25日，星期天我国赖氨酸生产状况南宁赖氨酸厂：1987年投产，生产能力6000吨/年。泉州赖氨酸厂：1989年与正大集团合资后改名为“泉州大泉赖氨酸有限公司”，生产能力为5000吨/年左右，使用国外菌种和技术。四川川化味之素公司是中日合资企业，赖氨酸生产能力为6000吨/年，使用日本菌种和技术。我国赖氨酸行业的特点是：总生产能力小、企业规模小、生产水平低，因而发展困难。第68页,共123页，2024年2月25日，星期天生产技术指标日本我国产酸水平/%104.5~6.5转化率/%5035提取率/%86~9571~90工厂最大规模/万吨

年-11.50.6生产成本比值12电耗/kwh

t-11600~22009117我国与日本发酵法赖氨酸生产(商业规模)技术指标对照第69页,共123页，2024年2月25日，星期天㈠菌种

赖氨酸的直接发酵法生产主要采用短杆菌属和棒杆菌属细菌的各种变异株。与大肠杆菌相比，短杆菌属和棒杆菌的L-赖氨酸生物合成调节机制较为简单，适合作为出发菌株（如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵短杆菌等）。一般来说，L-赖氨酸产生菌由亚硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、紫外线（UV）等诱变选育而得。第70页,共123页，2024年2月25日，星期天㈡赖氨酸的生物合成

1、L-赖氨酸生物合成途径微生物中的L-赖氨酸生物合成途径自1950年以来逐渐阐明。微生物的L-赖氨酸有两条生物合成途径，即二氨酸庚二酸途径（DAP途径）和α-氨基己二酸途径。细菌的L-赖氨酸生物合成途径为DAP途径。

第71页,共123页，2024年2月25日，星期天在谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌中的L-赖氨酸合成分支上第一个酶是二氢吡啶二羧酸合成酶（DDP合成酶或PS），它不受末端产物L-赖氨酸的反馈调节。

因此，AK是谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌的L-赖氨酸合成途径中唯一的关键酶。2、L-赖氨酸生物合成反馈调节机制第72页,共123页，2024年2月25日，星期天在乳糖发酵短杆菌中，AK不但受到末端产物L-赖氨酸、L-苏氨酸的协同反馈调节，L-赖氨酸单独过剩时AK活性也被抑制45%。此外，DDP合成酶还受到门冬氨酸族以外的L-亮氨酸的阻遏。第73页,共123页，2024年2月25日，星期天㈢L-赖氨酸产生菌的育种要点

1、解除反馈调节解除反馈调节包括解除代谢产物对关键酶的反馈抑制或阻遏。在DAP途径中，有3个关键酶起限速反应作用：门冬氨酸激酶（AK）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PC)

二氢吡啶二羧酸合成酶（DDP合成酶或PS）其中PC受门冬氨酸的反馈抑制，AK受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制，DDP合成酶受亮氨酸的代谢互锁作用。第74页,共123页，2024年2月25日，星期天AK反馈调节的解除（AK脱敏）AK（在黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌和乳糖发酵短杆菌中）只受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制。

第75页,共123页，2024年2月25日，星期天要解除对AK的反馈抑制，可以选用下表的结构类似物抗性突变株。除了选育结构类似物抗性突变株外，还可以选育组合型突变株，如营养缺陷型和结构类似物抗性组合突变株，由于其具有两者的优点，因而可大幅度地提高赖氨酸的产量。第76页,共123页，2024年2月25日，星期天第77页,共123页，2024年2月25日，星期天PC的脱敏与激活PC催化PEP生成Asp，PC受Asp的反馈抑制。在丙酮酸激酸催化下，PEP生成Pyr（丙酮酸）。为了增加Lys前体Asp的量，就必须切断生成PYR的支路，同时解除Asp对PC的反馈抑制。第78页,共123页，2024年2月25日，星期天第79页,共123页，2024年2月25日，星期天①选育ALA-或丙氨酸的温度敏感株（tmps）。②选育AspHxr、磺胺类药物抗性突变株。③选育FPs突变株。④用200～500μ/L的生物素激活PC。⑤选育在琥珀酸平板上快速生长的突变株。⑥构建丙酮酸激酶缺陷的工程菌株。⑦构建柠檬酸合成酶活力低或缺陷的工程菌株。⑧选育GluHxs突变株。⑨用乙酶CoA激活PC。⑩采用低糖流加法激活PC（糖浓度为4%～5%）。第80页,共123页，2024年2月25日，星期天2、切断或减弱支路代谢

选育营养缺陷型或渗漏突变株，即切断或减弱合成蛋氨酸和苏氨酸的分支途径，可达到积累赖氨酸的目的。高丝氨酸渗漏突变株（Hse1）是由于高丝氨酸脱氢酶（HD）活性下降但不完全丧失，使得代谢流发生变化，由原来优先合成高丝氨酸方向转向合成赖氨酸方向。由于生成的苏氨酸量不足于与赖氨酸共同对AK起协同反馈抑制作用，从而使赖氨酸得以积累。

第81页,共123页，2024年2月25日，星期天第82页,共123页，2024年2月25日，星期天3、解除代谢互锁作用

在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸的生物合成与亮氨酸之间存在着代谢互锁。赖氨酸生物合成分支途径的第一酶DDP合成酶的合成受到亮氨酸阻遏。在此情况下，副产物Ala、Val生成量显著地增加，这是因为PS的合成受到阻遏，酶活力显著降低，使丙酮酸通向赖氨酸的代谢受阻，而丙酮酸转向合成Ala、Val的结果。第83页,共123页，2024年2月25日，星期天第84页,共123页，2024年2月25日，星期天解除代谢互锁的方法包括：①选育亮氨酸缺陷突变株；②选育亮氨酸结构类似物抗性突变株；③选育亮氨酸温度敏感突变株；④选育对苯醌或喹啉衍生物敏感的突变株；⑤选育NAA-突变株（萘乙酸缺陷突变株）和亮氨酸温度敏感突变株。第85页,共123页，2024年2月25日，星期天4、改善膜的通透性代谢终产物（如Lys）在菌体内合成后，通过细胞膜渗透到发酵液中是非常重要的。一方面可以使产物易于提取，另一方面可以降低产物在菌体内的浓度，从而合产物达不到足以引起反馈抑制或阻遏的浓度。Tosaka等人对乳糖发酵短杆菌AECr突变株的研究，发现它的赖氨酸排出是通过主动运输系统来进行的，而且当培养基中Lys浓度相当于细胞内浓度的5倍时，仍能排出。第86页,共123页，2024年2月25日，星期天5、增加前体物的合成

①选育丙氨酸缺陷型：切断丙酮酸合成丙氨酸的代谢流，丙酮酸能充分用于合成Asp，增加Lys的产量；

②选育门冬氨酸结构类似抗性突变株；③选育适宜的CO2固定酶/TC循环酶活性比的突变株。第87页,共123页，2024年2月25日，星期天6、利用基因工程技术构建赖氨酸工程菌

棒杆菌属（Corynebacterium）催化赖氨酸生物合成酶的基因已被成功克隆。已发现将某些用来催化赖氨酸生物合成酶的基因导入寄主细胞能有效提高赖氨酸的产量。Richamd等把几个参与Lys合成的基因分别在具有高拷贝数的质粒pBR322上进行克隆，使拷贝数高达50以上。再转化大肠杆菌，改变了天冬氨酸激酶，最终使工程菌能产生比原菌株高5倍的Lys。第88页,共123页，2024年2月25日，星期天综上所述，在天冬氨酸族氨基酸代谢途径中，末端产物种类多，调节机制复杂，为了高效率生产赖氨酸，可以采取顺序解除各种调节机制的诱变育种方法，获得多重标记突变株。但是，采用人工诱变获得多重标记组合型突变株，是一件费时、费力、非常麻烦的工作。采用细胞工程和基因工程新技术，将诱变所获得的优良特性组合起来，获得高产菌株就容易得多。第89页,共123页，2024年2月25日，星期天1、赖氨酸的发酵控制赖氨酸生产菌大多是细菌，以谷氨酸生产菌为出发菌株，通过选育解除自身的代谢调节获得赖氨酸的高产菌株。也有酵母菌，但产量较细菌低。三、赖氨酸的发酵工艺第90页,共123页，2024年2月25日，星期天1）培养基中苏氨酸、蛋氨酸的控制

赖氨酸生产菌是高丝氨酸缺陷型突变株。苏氨酸和蛋氨酸是赖氨酸生产菌的生长因子。赖氨酸生产菌缺乏蛋白质分解酶，不能直接分解蛋白质，只能将有机氮源水解后才能被利用。发酵过程中，如果培养基中的苏氨酸和蛋氨酸丰富，就会出现只长菌体，而不产或少产赖氨酸的现象，所以要控制其在亚适量，当菌体生长到一定时间后，转入产酸期。

第91页,共123页，2024年2月25日，星期天2）生物素对赖氨酸的影响

赖氨酸生产菌大多是生物素缺陷型，如果在发酵培养基中限量添加生物素，赖氨酸发酵就会向谷氨酸转换，大量积累谷氨酸；若添加过量生物素，使细胞内合成的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶产生反馈抑制作用，则抑制谷氨酸的大量生成，使代谢流向合成门冬氨酸方向。因此，生物素可促进草酰乙酸生成，增加门冬氨酸的供给，提高赖氨酸的产量。

第92页,共123页，2024年2月25日，星期天3）赖氨酸发酵的工艺条件

发酵温度前期为32℃，中后期为34℃。pH＝6.5-7.5。发酵过程中，通过添加尿素或氨水来控制pH值，同时尿素和氨水还能为赖氨酸的生物合成提供氮源。种龄和接种量要求以对数生长期的种子为好，当采用二级种子扩大培养时，接种量约为2%，种龄一般为8-12h；当采用三级种子扩大培养时，接种量约为10%，种龄一般为6-8h。第93页,共123页，2024年2月25日，星期天控制溶解氧浓度对赖氨酸发酵很重要，赖氨酸发酵要求供氧充足。供氧不足，将导致乳酸积累，使细胞体内的赖氨酸和磷脂含量增加，而发酵液中赖氨酸含量很低，并可能导致赖氨酸生产受到不可逆抑制，该抑制作用与细胞膜透性有关。第94页,共123页，2024年2月25日，星期天2、赖氨酸的提取与精制

赖氨酸的提取过程包括发酵液预处理、提取和精制三个阶段。因游离的L-赖氨酸易吸附空气中的CO2，故结晶比较困难，一般商品都以L-赖氨酸盐酸盐的形式存在。

第95页,共123页，2024年2月25日，星期天1）发酵液预处理一般采用离心法（高速离心4000-65000r/min）除去菌体，添加絮凝剂（如聚丙烯酰胺、明矾等）沉淀。滤液用盐酸调节pH4.0后备用。第96页,共123页，2024年2月25日，星期天2）离子交换法提取赖氨酸从发酵液中提取赖氨酸通常有四种方法：①沉淀法；②有机溶剂抽提法；③离子交换法；④电渗析法。工业上大多采用离子交换法来提取赖氨酸。赖氨酸是碱性氨基酸，等电点为9.59，在pH＝2.0左右被强酸性阳离子交换树脂所吸附，pH＝7.0-9.0被弱酸性阳离子交换树脂所吸附。

第97页,共123页，2024年2月25日，星期天强酸性阳离子交换树脂的氢型对赖氨酸的吸附比铵型容易得多，但是铵型能选择性地吸附赖氨酸和其它碱性氨基酸，不吸附中性和酸性氨基酸，同时在用氨水洗脱赖氨酸后，树脂不必再生。所以从发酵液中提取赖氨酸均选用铵型强酸性阳离子交换树脂。第98页,共123页，2024年2月25日，星期天3）赖氨酸的精制离子交换柱的洗脱液中含游离赖氨酸和氢氧化铵。需经真空浓缩蒸去氨后，再用盐酸调至赖氨酸盐的等电点5.2，生成赖氨酸盐酸盐以含一个结晶水合物的形式析出。经离心分离后，在50℃以上进行干燥，去除结晶水即得赖氨酸盐酸盐成品。

第99页,共123页，2024年2月25日，星期天第四节苏氨酸的发酵及育种苏氨酸用于饲料工业、保健食品和医药工业，目前产量约5万吨。主要生产企业为日本味之素公司、德国德固赛公司、美国ADM公司、日本协和发酵工业公司等，其产量占全球份额的90%左右。制备方法有化学合成法、发酵法和蛋白质水解法，以发酵法最为先进；由微生物发酵生成的苏氨酸都是L-苏氨酸。第100页,共123页，2024年2月25日，星期天一、苏氨酸的育种途径第101页,共123页，2024年2月25日，星期天苏氨酸高产菌株应具备的生化特征DDP合成酶活力极弱或欠缺琥珀酰高丝氨酸合成酶酶活力极弱或欠缺苏氨酸脱氨酶酶活力极弱或欠缺CO2固定能力强天冬氨酸合成能力强天冬氨酸激酶活力强，对苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制不敏感高丝氨酸脱氢酶活力强，不受苏氨酸反馈调节。第102页,共123页，2024年2月25日，星期天二、选育苏氨酸生产菌的方法⑴切断或减弱支路代谢选育和利用营养缺陷型突变株（或营养渗漏型突变株，营养缺陷回复突变株）是积累苏氨酸的有效措施。①选育Lys-、Lysl、Lys+突变株②选育Met-、Metl、Met+突变株③选育Ile-、Ilel、Ile+突变株第103页,共123页，2024年2月25日，星期天⑵解除反馈调节在Thr发酵中，必须解除终产物对关键酶AK和HD的反馈调节。选育抗赖氨酸、抗苏氨酸结构类似物突变株，可以得到关键酶AK对苏氨酸、Lys协同反馈抑制脱敏的突变株。。如AHVr、ThrHxr、AECr、MLr、ALLr、LysHxr等。第104页,共123页，2024年2月25日，星期天⑶增加前体物的合成与Lys高产菌株的选育一样，增加前体物Asp的生成，可提高Thr的积累，其方法为：①选育Ala-突变株②选育抗Asp结构类似物突变株③选育谷氨酸结构类似物敏感突变株④利用平衡合成，通过添加乙醇、醋酸等增加乙酰CoA的生成。第105页,共123页，2024年2月25日，星期天⑷切断苏氨酸进一步代谢途径细胞可以苏氨酸为前体物进一步合成异亮氨酸，这必然会导致苏氨酸积累量的减少，为避免苏氨酸被菌体利用，还需切断苏氨酸进一步的代谢途径，即选育异亮氨酸缺陷型菌株（Ile-）或异亮氨酸渗漏型突变株（IleL）或异亮氨酸缺陷回复突变株（Ile+）。第106页,共123页，2024年2月25日，星期天⑸利用现代生物技术选育苏氨酸生成菌利用转导和原生质体转化法、原生质体融合技术选育苏氨酸生成菌；构建苏氨酸工程菌，最基本的方法是将苏氨酸生物合成途径中起限速作用的限速酶AK和HD的基因连接在多拷贝载体质粒上并克隆，排除生物合成途径中的瓶颈效应，提高苏氨酸产量。或者，将苏氨酸合成酶操纵子基因进行转化构建工程菌。

第107页,共123页，2024年2月25日，星期天第五节分支链氨基酸发酵的

代谢控制育种分支链氨基酸包括异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、缬氨酸（Val），由于这些氨基酸的分子中都具有由甲基侧链形成的分支结构，故称为分支链氨基酸