细胞增生和凋亡的分子

关于细胞增生和凋亡的分子20世纪70年代LelandHartwell提出了“细胞周期检验点”（cellcyclecheckpoint）概念。最先找到了用于研究真核细胞周期的合适模型——酵母细胞，通过研究他进一步提出了细胞分裂基因的概念，即cdc

(celldivisioncycle)基因。20世纪80年代TimHunt发现周期蛋白(cyclin)。1990年，PaulNurse发现周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependentkinase，CDK）。2001年10月8日美国人Leland

Hartwell、英国人PaulNurse、Timothy

Hunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖。第2页,共77页，2024年2月25日，星期天第一节生长因子信号转导活化细胞周期进程是细胞增生的分子机制第二节细胞凋亡是一种自发的程序性死亡第3页,共77页，2024年2月25日，星期天细胞周期细胞周期:大多数真核细胞经过一系列有序事件，使细胞体积增大，染色体复制，并且分裂成两个各含有一套完整的染色体的子代细胞细胞周期分为四个时期：G1,S,G2,M期第4页,共77页，2024年2月25日，星期天第5页,共77页，2024年2月25日，星期天G1期：从有丝分裂完成到DNA复制之前这一阶段，又叫复制前期。该期细胞内各种RNA、蛋白质合成增多。同时各种细胞群体之间细胞周期的差异取决于此期。S期：又称为DNA的合成期或复制期。该期细胞内遗传物质从二倍体到四倍体。组蛋白的合成也同时进行。第6页,共77页，2024年2月25日，星期天G2期：指DNA合成完成到有丝分裂开始这段时间，又称复制后期。该期DNA合成已终止，但仍然进行RNA和一定蛋白质的合成。同时线粒体DNA在此期复制。M期：又称为有丝分裂期。此期细胞呈球形，染色体在此期凝聚后分开，移向细胞两端，解聚并在形成两个完整的核，最后通过细胞质分裂，结束M期。该期蛋白质合成也显著减少，细胞质内的多核糖体大部分解体。第7页,共77页，2024年2月25日，星期天G1-SCheckpoint细胞周期中的四个关卡（checkpoint）：G1晚期限制点、G1-S转折和G2-M转折的DNA损伤关卡、有丝分裂中期关卡IsthedamagedDNArepaired?第8页,共77页，2024年2月25日，星期天二、有许多蛋白质参与调控细胞周期进程周期蛋白（Cyclin）周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase,Cdk）周期蛋白-周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）RB及E2F-DP1转录因子调节Cdk磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶泛素（ubiquitin）和使蛋白质泛素化（ubiquitination）的酶第9页,共77页，2024年2月25日，星期天1.细胞周期蛋白是一类含量随着不同细胞周期升高和降低的蛋白质，可分为A、B、D、E等。第10页,共77页，2024年2月25日，星期天细胞周期蛋白影响细胞内的含量因素基因表达增加—生长因子诱导降解—泛素介导运输—细胞核与细胞间质间第11页,共77页，2024年2月25日，星期天2.细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase,Cdk）Cdk是组成型表达的核内丝-苏氨酸蛋白激酶第12页,共77页，2024年2月25日，星期天部分周期蛋白结构分子特征周期蛋白盒介导周期蛋白与Cdk结合破坏框（Destructionbox,RXXLGXIXN）(X代表任意氨基酸)，破坏框之后为一段40个氨基酸组成的Lys富集区，破坏框主要参与由泛素介导的周期蛋白A和周期蛋白B的降解。PEST（脯、谷、丝、苏）与G1期周期蛋白的更新有关第13页,共77页，2024年2月25日，星期天第14页,共77页，2024年2月25日，星期天某些CKD与周期蛋白的配对关系及执行功能的时期第15页,共77页，2024年2月25日，星期天3.CKI(cyclin-dependentkinaseinhibitor)抑制Cdk及周期蛋白-Cdk复合物的活性1.Cdk4/Cdk6抑制因子家族有P15、P16、P18、P19等。抑制CyclinD与Cdk4/Cdk6结合，及其复合物的激酶活性。2.Cip/Kip家族Cytokine-inducibleprotein/kinaseinteractingprotein有P21、P27、P57等。是细胞接受到接触抑制、DNA损伤、低氧及某些细胞因子等信号后的产物；与Cyclin-Cdk复合物结合，抑制它们的活性第16页,共77页，2024年2月25日，星期天1.Cdk4/Cdk6抑制因子家族2.Cip/Kip家族第17页,共77页，2024年2月25日，星期天4.Rb蛋白与转录因子E2F-DP1的结合对G1期进展产生负调节作用Rb(retinoblastomaprotein)（视网膜母细胞瘤基因）RB基因产物是一个核内蛋白，有两种形式，磷酸化和去磷酸化。RB的表达和磷酸化水平与细胞周期有关第18页,共77页，2024年2月25日，星期天第19页,共77页，2024年2月25日，星期天5.使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也调节Cdk的活性CDK1的调节与活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase第20页,共77页，2024年2月25日，星期天6.泛素-蛋白酶体介导蛋白质降解也起调节细胞周期的作用短命蛋白通过多泛素化途径降解，如Cyclin、P21、P27、E2F、Weel等。第21页,共77页，2024年2月25日，星期天参与细胞周期调控的泛素连接酶至少有两类SCF（skp1-cullin-F-boxprotein，三个蛋白构成的复合体）负责将泛素连接到G1/S期周期蛋白（D、E）和p21、p27、E2F、Weel上；APC(anaphasepromotingcomplex)负责将泛素连接到M期周期蛋白（A、B）上。

第22页,共77页，2024年2月25日，星期天第23页,共77页，2024年2月25日，星期天三，调节蛋白协同作用调控细胞周期Cdk4/6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键因素Cdk1活化是G2M关卡处关键调控因素APC介导的多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入G1期的关键调控因素DNA损伤关卡与G1及G2期停滞相关第24页,共77页，2024年2月25日，星期天1.Cdk4/6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键因素第25页,共77页，2024年2月25日，星期天第26页,共77页，2024年2月25日，星期天2.Cdk1活化是G2M关卡处关键调控因素第27页,共77页，2024年2月25日，星期天第28页,共77页，2024年2月25日，星期天3.APC介导的多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入G1期的关键调控因素后期促进因子(AnaphasePromotingComplexAPC）介导选择性降解的靶蛋白与Ubiquitin结合(通过泛素依赖性途径降解)。APC主要介导两类蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin。前者维持姐妹染色单体粘连,抑制后期启动；后者的降解意味着有丝分裂即将结束，即染色体开始去凝集，核膜重建。第29页,共77页，2024年2月25日，星期天第30页,共77页，2024年2月25日，星期天4.DNA损伤关卡与G1及G2期停滞相关G2期的停滞涉及一系列的磷酸化过程转录因子P53能使细胞停滞在G1期和G2期第31页,共77页，2024年2月25日，星期天G2期的停滞涉及一系列的磷酸化过程第32页,共77页，2024年2月25日，星期天转录因子P53能使细胞停滞在G1期及G2期第33页,共77页，2024年2月25日，星期天四，生长因子等细胞外因素通过信号转导调控细胞周期细胞从G0期进入细胞周期依赖多种生长因子的协同促进作用第34页,共77页，2024年2月25日，星期天G1期的细胞也需要生长因子促进细胞周期的进程第35页,共77页，2024年2月25日，星期天第二节细胞凋亡是一种自发的程序化细胞死亡细胞凋亡机制涉及胱天蛋白酶的级联活化死亡受体途径及线粒体途径是两种主要的凋亡信号转导途径第36页,共77页，2024年2月25日，星期天细胞死亡分为两大类：1、由各种突发的，意外的事件所致的细胞死亡(病理性死亡)，形态学上表现为细胞坏死(necrosis)。2、程序性细胞死亡，形态学上表现为细胞凋亡(apoptosis)。凋亡是多细胞生物发育及成体中维持体内平衡的一种正常事件第37页,共77页，2024年2月25日，星期天例如蝌蚪尾的消失脊椎动物的神经系统的发育发育过程中手和足的成形过程第38页,共77页，2024年2月25日，星期天第39页,共77页，2024年2月25日，星期天细胞凋亡与细胞坏死的区别—————————————————————————————————————————————————————————坏死凋亡1.性质2.诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生3.生化特点4.形态变化6.DNA电泳5.炎症反应7.凋亡小体8.基因调控被动过程，无新蛋白合成，不耗能主动过程，有新蛋白合成，耗能细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩弥散性降解，电泳呈均一DNA片状DNA片段化(180-200bp)，电泳呈“梯”状条带溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应有病理性，非特异性生理性或病理性，特异性无有无第40页,共77页，2024年2月25日，星期天坏死凋亡第41页,共77页，2024年2月25日，星期天确保胚胎发生、器官发育，调节细胞群体维持内环境稳定发挥积极的防御功能凋亡的生理意义凋亡的病理意义器官功能障碍凋亡的意义恶性肿瘤发生第42页,共77页，2024年2月25日，星期天二，凋亡途径是由诱导产生的胱天蛋白酶级联反应凋亡途径最早在线虫中被阐明秀丽隐杆线虫（CaenorbabditisElegans)第43页,共77页，2024年2月25日，星期天麻省理工学院的RobertHorvitz领导的研究小组采用体细胞突变的方法发现共有14个基因在C.elegans细胞凋亡中起作用第44页,共77页，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2002"fortheirdiscoveriesconcerning'geneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath'"SydneyBrenner

H.RobertHorvitz

JohnE.Sulston

TheMolecularSciencesInstitute

Berkeley,CA,USAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USATheWellcomeTrustSangerInstitute

Cambridge,UnitedKingdom第45页,共77页，2024年2月25日，星期天Duringdevelopment,1090cellsaregenerated,butprecisely131ofthesecellsareeliminatedbyprogrammedcelldeath.Thisresultsinanadultnematode(thehermaphrodite),composedof959somaticcells.第46页,共77页，2024年2月25日，星期天第47页,共77页，2024年2月25日，星期天2.哺乳动物细胞凋亡途径与线虫凋亡途径相似但更为复杂Ced3---胱天蛋白酶（cysteinylaspartate-specificprotease,caspase）Ced4---凋亡蛋白酶活化因子1（apoptoticprotease-activatingfactor1,Apaf1）Ced9和Egl-1---Bcl-2家族第48页,共77页，2024年2月25日，星期天3.哺乳动物中Caspase家族成员有相似的结构与活化过程第49页,共77页，2024年2月25日，星期天第50页,共77页，2024年2月25日，星期天4.哺乳动物的Bcl-2家族是凋亡调节蛋白第51页,共77页，2024年2月25日，星期天二，死亡受体途径及线粒体途径是两种主要的凋亡信号转导途径第52页,共77页，2024年2月25日，星期天1.死亡受体途径死亡受体：Fas、TNFR1、TNFR2、DR3、DR4、DR5、DcR1和DcR2等一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的跨胞膜蛋白。通路：第53页,共77页，2024年2月25日，星期天第54页,共77页，2024年2月25日，星期天TNF受体途径1、TNF和TNF受体TNF(tumornecrosisfactor)：称为肿瘤坏死因子，是一种具有多种生物学效应的细胞因子，主要由激活的单核巨噬细胞和T淋巴细胞产生。TNF受体：目前发现的有TNFR1和TNFR2。两种都为跨膜蛋白。TNFR1能引起细胞凋亡，而TNFR2却不能引起细胞凋亡。第55页,共77页，2024年2月25日，星期天2、TNF受体途径的作用：促进细胞生长、分化、凋亡和诱发炎症。3、TNF受体途径:1）TNF－α与TNFR1胞外区结合，使TNFR1形成三聚体。（一个TNF－α与三个TNFR1分子结合）2）三聚体TNFR1通过其聚集的胞内区死亡结构域（DD）招募下游信号传导蛋白（TRADD、FADD、TRAF2、RIP）。3）下游信号传导蛋白形成复合体，激活下游的caspase8以及各种效应分子caspases，产生级联激活反应，最终引起靶细胞凋亡。4）TNF还可通过下游激活蛋白RIP，TRAF2等，分别激活NIK和MEKK，从而激活NF－KB和c－Jun，抑制细胞凋亡。第56页,共77页，2024年2月25日，星期天TNF受体途径第57页,共77页，2024年2月25日，星期天2.内源性线粒体途径第58页,共77页，2024年2月25日，星期天3.细胞凋亡的检测方法.一、细胞凋亡的形态学检测.二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）三、线粒体膜势能（

mt）的检测四、DNA片断化检测

五、TUNEL法六、Caspase-3活性的检测

七、WB检测第59页,共77页，2024年2月25日，星期天

细胞凋亡的形态学检测

1光学显微镜和倒置显微镜

未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。3电子显微镜观察第60页,共77页，2024年2月25日，星期天NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess

（488nm

400）第61页,共77页，2024年2月25日，星期天电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。第62页,共77页，2024年2月25日，星期天磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35

36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。第63页,共77页，2024年2月25日，星期天第64页,共77页，2024年2月25日，星期天