固定化细胞生产技术

ImmobilizedEnzyme固定化酶和固定化细胞什么是固定化细胞？悬浮细胞水不溶性载体固定化细胞固定化技术固定化酶：经提取和分离纯化后的酶固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片固定化细胞（活细胞）：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞固定化动物细胞固定化植物细胞固定化原生质体随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。1986年至今，利用固定化原生质体技术进行胞外酶的生产研究。用固定化枯草杆菌原生质体生产细胞间质中存在的碱性磷酸酶等，前景广阔。一、固定化细胞的制备固定化方法细胞的固定化方法吸附法结合法交联法包埋法网格型微囊型热处理法1、吸附法

利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。（1）无机吸附载体：矿物质和其它无机载体。

高岭土：胰凝乳蛋白酶

皂土：过氧化氢酶、核糖核酸酶氧化铝：葡萄糖氧化酶二氧化硅（覆盖卵磷脂/脑磷脂）：酸性磷酸酯酶、磷酸葡萄糖变位酶。不锈钢：直径100-200粒子，以氧化钛处理，可吸附β-半乳糖苷酶（17mg/g载体）。载体类型性质：良好粘结性粒度和细度较强结合能力离子吸附性及交换性影响因素pH：pH变化影响载体和酶蛋白的电荷，从而影响酶的吸附。一般在蛋白的等电点时可达最大吸附。(2)盐：影响复杂。一般会阻止吸附。实际上已被用来洗脱从低盐溶液吸附的酶。个别情况可促进蛋白的吸附于原来不吸附的惰性支持物上。(3)温度：随温度升高而增加吸附量。但酶失活会加速(4)载体：与载体表面积、多孔度、载体预处理有关。颗粒越小则吸附越好。多孔载体与孔的大小和表面积有关。另外载体的预处理是极为重要的：有的载体会影响酶的结合量、有的会引起酶变性、有的会降低酶的活性。例如多孔硅，其表面有较高的酸性而易使酶变性，需要用缓冲液进行予处理。

吸附法优缺点(1)优点①操作简单;②可充分选择不同电荷、不同形状的载体;③酶与细胞的纯化和固定化可在吸附过程中一步完成;④酶使用过程的失活可重新活化;⑤载体可再生(2)缺点①pH、温度、离子强度、时间等多因素对固定化酶及细胞影响复杂，不同酶、不同载体的情况各不相同。②最适量的选择是经验性的。③吸附程度和固定化细胞的活力间不一定平行。④细胞与载体结合力不强，易导致催化力丧失和污染反应产物。2、包埋法

将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。根据载体材料和方法的不同，可分为：凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。半透膜包埋法：将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化细胞。常用于制备固定化细胞的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等琼脂凝胶包埋法将一定量的琼脂加入到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至48~55°C，加入一定量的酶液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶粒，分离后洗净备用。缺点：机械强度较差，底物、产物扩散困难，故使用受限制海藻酸钙凝胶包埋法称取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的酶液或细胞混合均匀，然后用注射器或滴管将冷凝悬液滴到一定浓度的氯化钙溶液中。优点：操作简便、条件温和，对细胞无毒害，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径。使用时注意控制培养基中磷酸盐的浓度，维持一定的钙离子浓度。海藻酸钙包埋法装置将水溶性的海藻酸钠配成水溶液，并把酶或细胞分散在其中，然后将其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸钠中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。颗粒大小可实时监控角叉菜胶包埋法角叉菜，属褐藻门，杉藻科，角叉菜属，自然分布于大西洋沿岸和我国东南沿海以及青岛、大连等海域，是中国的一种重要经济海藻。角叉菜不仅是卡拉胶生产的重要原藻，而且近年来越来越多地应用于医药领域，引起人们的广泛关注。将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热溶解。灭菌后冷却到30-50°C，与一定量的细胞液等混合均匀后，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化钾溶液中的到球状固定化颗粒。优点：通透性能好，对细胞无毒害。聚丙烯酰胺凝胶包埋法先配置一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（N,N‘-甲叉双丙烯酰胺，别名MBA，又叫亚甲基双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰胺，N,N’-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则自交联，微溶于水、乙醇）与一定量的酶液等混合均匀后加入一定量的过硫酸钙和四甲基乙二胺，混合后让其静置聚合即可获得。优点：机械强度高，可调节凝胶孔径缺点：丙烯酰胺单体有毒性光交联树脂包埋法例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50℃，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得优点：强度高、使用时间长固定化时间短凝胶包埋法凝胶包埋条件酶活性强度天然凝胶琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶温和不变差合成凝胶聚丙烯酰胺、光交联树脂聚合反应部分失活高使用的多孔载体及其特点3、结合法

选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。共价键结合法概念：非水溶性载体与酶以共价键的形式结合可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体可与载体共价结合的酶的功能团

——氨基、羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。

——参与共价结合的氨基酸残基不应是

酶催化活性所必需的，否则往往造

成固定后的酶活性完全丧失。共价键结合法制备固定化酶/细胞的“通式”首先载体上引进活泼基团

然后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键共价结合法的优点

——与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。缺点

—反应条件苛刻，操作复杂；

—会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心。

因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为30％左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。4、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短—双重固定法。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。二、固定化方法与载体的选择

原则1

——固定化细胞应用的安全性，尽可能选择无毒性试剂参与的方法。原则2

——固定化酶应有最大的稳定性，在制备固定化酶时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。原则3

——固定化酶成本要低，应为廉价的、有利于推广的产品，以便于工业使用。三、固定化细胞的性质将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化。本章目录1、稳定性提高贮存稳定性和操作稳定性比游离酶大多数提高对热稳定性绝大多数提高对蛋白类分解酶的稳定性提高对变性剂的耐受力升高2、固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有特例：不同方法、不同载体对同一种酶进行固定化，最适温度可能不同。3、固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起。作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化如氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶