组蛋白去乙酰化酶HDAC11在乳腺癌细胞的初步表达研究

组蛋白去乙酰化酶HDAC11在乳腺癌中的初步研究【摘要】目的：乳腺癌位于我国发生在女性癌症发病率最高的癌症之一，一直未有十分有效的治疗手段。近年来，分子靶向治疗成为重要的研究手段，研究发现组蛋白去乙酰化酶参与调控乳腺癌肿瘤的发生发展，但在众多研究中，对于HDAC11在乳腺癌中的研究较少。方法：本论文通过生物信息学分析对人组蛋白去乙酰化酶HDAC11进行功能预测，包括结构域，同源性，3D结构，在肿瘤的表达量等，并构建过表达载体HDAC11检测其在乳腺癌中表达。结果：本论文首先对组蛋白去乙酰化酶HDAC11作了生物信息学分析和预测，结果显示HDAC11在进化上相对保守，并对HDAC11的3D结构域和互作蛋白进行了预测，以及预测了人的HDAC11基因在肿瘤及乳腺癌中的表达谱，其在乳腺癌中异常表达，随后构建了HDAC11载体，成功在乳腺癌细胞MCF-7中表达。结论：本实验为组蛋白去乙酰化酶HDAC11在乳腺癌的进一步研究做了铺垫，为乳腺癌的新药研发提供了新的理论基础。【关键词】乳腺癌；去乙酰化酶；功能预测Preliminarystudyofhistonedeacetylaseinbreastcancer[Abstract]Inourcountry,breastcancerisoneofthehighestratesoffemalecancers,andtherearenoveryeffectivetreatments.Inrecentyears,moleculartargetedtherapyhasbecomeanimportantmeansofresearch.Studieshavefoundthathistonedeacetylaseisinvolvedinregulatingtheoccurrenceanddevelopmentofbreastcancertumors.However,innumerousstudies,therearefewstudiesoninbreastcancer.Therefore,inthispaper,thefunctionpredictionofhumanhistonedeacetylasewascarriedoutthroughbioinformaticsanalysis,includingdomain,homology,3Dstructure,expressionamountintumor,etc.,andtheoverexpressionvectorwasconstructedtoexpressinbreastcancer.Resultsandconclusions:Inthispaper,thehistonedeacetylasewasanalyzedandpredictedbybioinformatics.Theresultsshowedthatwasrelativelyconservedinevolution.The3Ddomainandinteractingproteinsofwerepredicted,andtheexpressionprofileofhumangenewaspredictedintumorandbreastcancer.Subsequently,vectorwasconstructedandsuccessfullyexpressedinbreastcancercellsMCF-7.Itpavedthewayforthefurtherstudyofhistoneinbreastcancerandprovidesanewtheoreticalbasisfortheresearchanddevelopmentofnewdrugsforbreastcancer.[Keywords]Breastcancerdeacetylasefunctionprediction目录1前言 -1-1前言研究背景HDACs能在多种肿瘤组织细胞中实现高表达，是一种应用广泛的组蛋白去乙酰化酶家族，该酶在肿瘤的发生过程以及发展过程中会发挥相应作用，根据该作用，可以推测HDACs是治疗肿瘤的有效靶点。组蛋白去乙酰化酶属于蛋白酶类型，HDACs发挥抗肿瘤作用是通过改变染色体结构并且调节基因的表达过程的作用机制进行的。在调控基因动态表达方面，组蛋白的翻译后修饰有着重要的作用。组蛋白翻译后修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、ADP-核糖基化、泛素化和小分子类泛素化ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[1]。有研究表明HDAC11可调控NKG2D-CAR-T细胞的效应功能，由此发挥HDAC11抗肿瘤作用ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[2]。HDACs通过在肿瘤细胞里实现过度表达的方式，以增强其去乙酰化的效果，进而抑制其中特定基因的表达过程。因此，HDACs能够影响肿瘤细胞的发展过程ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[3]。HDAC11是第Ⅳ类HDAC的唯一代表，是Gao等人于2002年通过基因数据库对酵母Hos3的同源序列搜索发现的。HDAC11主要负责调控DNA复制因子CDT1的蛋白质稳定性，并调控Interleukin10的表达ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[4]。哺乳动物细胞中目前已发现18种HDACs，并将HDACs分为四类，分别为I类（包括HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8）、II类（包括HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10）、III类、IV类（仅包含HDAC11）。其中，组蛋白去乙酰化酶11是HDAC家族中唯一的Ⅳ类成员，是现如今发现的最小的HDAC成员。表1HDAC的分类和特点HDACclassificationMemberscharacteristicsⅠclassHDAC1、2、3、8Zn+dependenttype,distributedinthenucleusⅡclassaHDAC4、5、7、9Zn+dependenttype,distributedinthenucleusorcytoplasmⅡclassbHDAC6、10Zn+dependenttype,distributedincytoplasmⅢclassSIRT1、2、3、4、5、6、7NAD+dependenttype,distributedinthenucleus,cytoplasmormitochondriaⅣclassHDAC11Zn+dependenttype,distributedinthenucleusHDAC11是一种生物蛋白，具有多种功能，可以发挥多种酶活性，HDAC11分布在细胞质与细胞核中，结构简单，有一个开放阅读框，编码347残基蛋白与Ⅰ类、Ⅱ类HDAC蛋白，在催化核心区具有相同的序列相似性。HDAC11可以调节组蛋白的去乙酰化，进行mRNA的剪切以及非组蛋白结合ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[5-6]。乳腺癌是最常见的癌症类型ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[7]。乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下发生增殖失控而出现的恶性病变，乳房肿块、腋窝淋巴结肿大等是其早期表现，晚期会出现远处转移，危及人们的生命健康[8]。乳腺癌具有高度异质性，根据分子分型主要分为3类：三阴性乳腺癌、人表皮生长因子受体阳性乳腺癌、激素受体阳性乳腺癌ADDINNE.Ref.{EA1CE028-AEC2-47D9-A7BC-551C219287CC}[9]。根据分子水平可被分为4种分子亚型，即管腔上皮A型、管腔上皮B型、HER2过表达型、三阴性乳腺癌[10]。肿瘤标志物可用于乳腺癌筛检、诊疗及预后监测，可细分为糖类抗原153、癌胚抗原、细胞角蛋白片段9、糖类抗原125和组织多肽特异性抗原、原癌基因人表皮生长因子2[11]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂是靶向癌细胞表观基因组的代表性药物，美国食品监督管理局（FDA）批准了以组蛋白与乙酰化酶抑制剂为代表的多种表观遗传药物用于肿瘤治疗。多种肿瘤的发生发展与组蛋白去乙酰化酶的异常表达关系密切，所以抗肿瘤治疗方式可以从靶向遗传异常表达的HDACs寻找。靶向异常表达的HDACs已被认为是一种有效的抗肿瘤治疗方式[12]。目前，组蛋白去乙酰化酶HDAC11在乳腺癌中的作用机制及影响的相关研究较少，在此对其进行相关预测及研究。研究意义中国是世界上乳腺癌发病率最高的国家，并且中国乳腺癌发病率正呈现上升趋势，2020年中国确诊乳腺癌总人数为416317例,死亡数则为117174例[13]，所以有必要对乳腺癌发病后的作用机制及影响进行探究，从而寻找乳腺癌的治疗手段。通过去获取乙酰化酶HDAC11CDS序列，对其结构域，互作蛋白，3D结构，肿瘤表达谱进行了预测，并通过基因工程技术构建了过表达HDAC11载体并将其导入乳腺癌MCF-7细胞中，初步探究HDAC11过表达载体能够在人乳腺癌细胞中表达。本论文深化了对去乙酰化酶HDAC11的认识，为拓宽乳腺癌治疗途径提供了理论基础。

2材料与方法2.1供试材料表2供试材料实验对象人乳腺癌细胞系（MCF-7）试剂、试剂盒反转录试剂盒、引物HDAC11-F(10μM)、引物HDAC11-R(10μM)、引物HDAC11-HA-R(10μM)、2×HieffCanace®

PlusPCRMasterMix(WithDye)、ddH2O、EcoRI酶、XhoI酶、10×buffer、T4ligase、T4ligasebuffer、大肠杆菌DH5α感受态细胞、Translntro®PL、RIPA裂解液、丙烯酰胺、SDS、Tris-HCl、β-巯基乙醇、甘氨酸、Tris、BCA试剂盒、甲醇、PBS、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、乙酸、脱脂奶粉、H2O2、Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、红细胞裂解液、DEPC处理水、dNTP混合物、RNA反转录酶、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)1s、2×SYBRGreenqPCRMix、一抗。仪器、耗材电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、硝酸纤维素膜、匀浆器、剪刀、移液枪、刮棒、PCR仪2.2生物信息学的分析利用NCBI数据库，查找和分析目的基因HDAC11的序列，在Genbank中比对该序列的同源序列，利用NCBI对HDAC11进行结构域的分析。基于silkdatabase3.0（）在线生物信息学分析了组蛋白去乙酰化酶HDAC11，在线网站GEPIA2（/#general）对人的HDAC11基因在不同肿瘤的表达谱分析。2.3构建过表达HDAC11载体2.3.1重组HDAC11载体的构建及鉴定cDNA提取：表3cDNA提取步骤与双酶切步骤实验过程1以Trizol法提取人乳腺癌的细胞MCF-7总RNA，根据反转录试剂盒使用说明，将mRNA反转录成cDNA第一链，以此为模板扩增HDAC11基因片段。2将第一轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。3以第一轮PCR产物为模板进行第二轮带标签的反向引物的PCR。4将第二轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，经上述两轮PCR后得到HDAC11基因片段。第一轮PCR体系、程序见表4、表5；第二轮PCR体系程序见表6、表7。5以限制性内切酶EcoRI和XhoI分别双酶切HDAC11基因片段和pcDNA3.1+载体，双酶切体系见表8、表96HDAC11基因与载体的连接及连接产物转化：将HDAC11基因和pcDNA3.1+载体双酶切体系于水浴锅中37℃反应5-6h。切割后经1%琼脂糖凝胶电泳分离，回收后在T4ligase连接酶的作用下16℃连接过夜，连接体系如表10表4PCR体系组分体积（μl）DNA模板2引物HDAC11-F(10μM)2引物HDAC11-R(10μM)22×HieffCanace®

PlusPCRMasterMix(WithDye)25ddH2O19表5PCR程序步骤温度时间循环次数预变性98°C3min1变性98°C10sec30退火60°C20sec30延伸72°C45sec30终延伸72°C5min1表6PCR体系组分体积（μl）DNA模板2引物HDAC11-F(10μM)2引物HDAC11-HA-R(10μM)22×HieffCanace®

PlusPCRMasterMix(WithDye)25ddH2O19表7PCR程序步骤温度时间循环次数预变性98°C3min1变性98°C10sec30退火60°C20sec30延伸72°C45sec30终延伸72°C5min1表8HDAC11基因双酶切体系组分体积（μl）HDAC11基因35EcoRI酶2XhoI酶210×buffer6ddH2O5表9pcDNA3.1+载体双酶切体系组分体积（μl）pcDNA3.1+载体35EcoRI酶2XhoI酶210×buffer6ddH2O5表10连接体系组分体积（μl）酶切pcDNA3.1+载体2.5酶切HDAC11基因5T4ligase0.5T4ligasebuffer1ddH2O1总的RNA提取与cDNA合成：用胰蛋白酶将贴壁细胞消化下来并收集后，再加入1mLTrizol进行裂解。冰上孵育、离心，取上清液。氯仿孵育、离心，小心转移上层水相。紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度。琼脂糖凝胶电泳测定RNA条带完整度。反转录成cDNA。质粒转化：表11质粒转化步骤步骤实验操作1将过夜连接的产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞与HDAC11质粒混合2冰上放置30分钟342℃金属浴90s4加入500μlLB培养基后，37℃、2000r摇床2小时55000转离心4分钟，弃置420μl上清液6取50μl剩余液涂布于LB培养板（含有氨苄抗生素）上7置于恒温摇床上37℃过夜培养后，挑取独立存在的单个菌落进行菌落PCR菌落的扩大培养：将培养好的大肠杆菌单菌落进行挑菌，将单菌落置于含有1ml氨苄培养基的ep管中，37℃2000转摇床1个小时，然后加入100μl摇床后的大肠杆菌至40ml氨苄培养基中，将其摇床扩大培养12-16小时，扩大培养后进行HDAC11质粒的抽取操作。HDAC11质粒的抽取：表12质粒抽取过程步骤实验过程13,000-5,000×g离心10min，收集10~15ml菌体2倒弃培养基。加入500ulBufferP1/RNaseA。高速涡旋使细菌充分重悬3待细菌重悬后，往重悬液中加入500μlBufferP2，颠倒混匀10次。室温放置3分钟，其间颠倒混匀5次4加入250μlButterLEN3至裂解液中，立即颠倒10~15次513000×g离心10min6转移0.95ml上清液至2.0ml离心管中，加入0.95mlBufferLN4至上清中，颠倒混匀5次7将HiPureDNAMiniColumnⅢ柱套在收集管中，转移750ul混合液至柱子中。13,000xg离心60s8倒弃滤液，把柱子套回收集管中，转移750μl混合液至柱子中。13,000xg离心60s9倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入500μlBufferPW1至柱子中。13,000xg离心60s10倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入650μlBufferPW2至柱子中。13,000xg离心30~60s11倒弃滤液，把柱子套回收集管中，13,000xg离心2min干燥柱子去除乙醇12把柱子套在灭菌的1.5ml离心管中，加入40~80μlElutionBuffer至柱子腹中央。静置2min，13000×g离心1min洗脱DNA13弃去柱子，把质粒保存至-20°C2.3.2重组HDAC11质粒转染人乳腺癌细胞MCF-7表13细胞转染步骤步骤实验过程1将MCF-7人乳腺癌细胞接种于6孔板中，细胞培养24h，24h后观察细胞密度，若细胞密度达到80%，则可进行细胞转染2转染之前将6孔板中培养基换成不含血清的Opti-MEM培养基3对于每孔细胞，使用250μl无血清培养基稀释3μg的重组HDAC11质粒，混匀。另外使用250μl无血清培养基稀释5-10μl的HieffTransR脂质体核酸转染试剂4将稀释的DNA和稀释的脂质体核酸转染试剂混匀，静置15min，5将质粒与转染试剂的混合液加入至6孔板中，于37℃CO2培养箱培养6细胞转染5h后更换为完全培养基继续培养48h，后续可进行蛋白提取操作2.4检测HDAC11对乳腺癌细胞的影响细胞形态观察：用显微镜观察转染重组HDAC11后人乳腺癌细胞MCF-7。蛋白提取：表14提取蛋白过程步骤实验过程1细胞转染48h后，将6孔板中的废液弃置，每孔用1mlPBS清洗2加入0.5ml胰酶于6孔板中15-30秒，待贴壁细胞与板脱落，弃置胰酶，每孔加入1mlPBS，反复吹打，直至贴壁细胞全部吹打下来3将吹打下来的贴壁细胞转移至1.5mlep管中，再置于离心机5000r离心10分钟，弃置上清液，留下沉淀物。4在另一ep管中配置1200微升细胞裂解液与12微升的蛋白酶抑制剂的混合溶剂，在每个带有沉淀物的ep管中加入90微升的混合溶剂，将混合溶液震荡15秒5将震荡后的混合溶液在冰上放置30分钟6冰上放置30分钟后于4摄氏度12000r离心15分钟7离心后，取80微升上清液，加入20微升的SDS

sample

buffer8100摄氏度水浴15分钟后于-20摄氏度冷藏蛋白免疫印记法检测HDAC11的表达：表15蛋白免疫印迹法实验过程步骤实验过程1SDS电泳：根据表14配制分离胶，将分离胶置于预制装置中，30-40min后，待分离胶凝固，再将据表14配制好的浓缩胶加至于凝固后的浓缩胶，立即插上15mm的梳子，一般在20-30min后可将梳子拔去。后将提取的蛋白上样，并加上marker，随后进行电泳，电泳时先低压80V跑30-40min，随后120V跑1h30min左右，直至5×loadingbuffer跑出来2转膜需提前做好准备：根据胶体大小将PVDF膜裁剪，先将PVDF膜在甲醇（100%纯度）中浸泡10min，并将6张厚度的滤纸（长宽与PVDF膜相同）和PVDF膜浸入到预冷的transferbuffer5min3面包夹的制备：先切除浓缩胶，再将分离凝胶放在3层滤纸上，面包夹黑色的一面朝下，PVDF膜置于分离胶的上方，在PVDF膜的右上角做好标记，光面朝向分离胶，用铲胶板赶走存在于PVDF膜与分离胶之间气泡，最后在PVDF膜上放另3张滤纸，并放入转膜电泳槽中4转膜：连接正负极，红色对准红色，黑色对准黑色，在4℃的条件下在400mA的条件下转膜100min左右5封闭：用镊子把转膜后的PVDF膜取出来，放到5%脱脂奶粉（1×TBST溶解）中，并放到摇床上常温封闭30min6孵育一抗：根据蛋白marker对PVDF膜进行裁剪，并按照抗体的说明书用一抗稀释液进行稀释，将稀释的抗体放入到15mLEP管中，将裁剪的PVDF放入对应的抗体管中，放入4℃摇床，孵育11h。一抗重复回收利用7洗PVDF膜：将PVDF膜放入10cm的皿上，在20mL1×TBST室温清洗3次，每次12min8二抗杂交：根据一抗的来源，选择不同的二抗，将膜放入配制好的二抗稀释液（5%的脱脂奶粉）中杂交，一般孵育时间在2-4h，常温杂交即可9洗PVDF膜：将PVDF膜放入10cm的皿上，在20mL1×TBST室温清洗3次，每次12min10曝光：先把配制好的ECL发光液置于曝光黑盒中，将洗好的PVDF膜有顺序地放入其中，利用仪器进行曝光，选取不同的曝光时间来保存图片.表16SDS凝胶的具体配制方法贮存液12%分离胶（mL）5%浓缩胶（mL）ddH2O6.65.430%（w/v）丙烯酰胺8.01.31分离胶溶液5—浓缩胶溶液—1无水10%SDS0.20.0810%AP0.020.085%TEMED0.0080.008Totalvolume208

3结果与分析3.1人的HDAC11的同源性分析通过NCBI将人（Homosapeins）中的HDAC11与昆虫的黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）进行同源性序列比对，发现人的HDAC11与黑腹果蝇只有52%的保守性，说明HDAC11在进化上相对保守，结果如图所示（图1）。图1同源序列比对分析结果3.2HDAC11的3D结构域预测HDAC11，作为组蛋白去乙酰化酶，主要负责核心组蛋白(H2A,H2B,H3和H4)的N端赖氨酸残基的去乙酰化。在转录调控、细胞周期进程和发育事件中起着重要作用。组蛋白去乙酰化酶通过形成大的多蛋白复合物起作用。以下是预测到HDAC11的3D结构域，是一个富含α螺旋和β螺旋的结构域，编码一个组蛋白去乙酰化酶区域，参与表观遗传修饰调控。图2HDAC11的3D结构域预测3.3HDAC11互作蛋白预测为了探究HDAC11的互相作用蛋白，利用在线网站String数据（/）对质之间相互作用的。通过在线网站预测组蛋白去乙酰化酶HDAC11能够与HDAC6（Histonedeacetylase6;），KAT2B（HistoneacetyltransferaseKAT2B），SIRT5（NAD-dependentproteindeacylasesirtuin-5），SIRT7（NAD-dependentproteindeacylasesirtuin-7）等蛋白相互作用，推测其在转录调控、DNA修复、DNA复制和染色体稳定性中发挥核心作用，并且可通过翻译后修饰和核小体重塑来调调控其他蛋白表达。图3HDAC11的互作蛋白预测3.4人的HDAC11基因在肿瘤的表达谱预测利用在线网站GEPIA2（/#general）对人的HDAC11在不同肿瘤的表达谱分析发现，HDAC11相对于正常的组织，其在乳腺癌中表达量较高，暗示其可能在乳腺癌中发现着一定的生物学功能。图4HDAC11在不同肿瘤中的表达谱预测3.5人的HDAC11基因在乳腺癌中的表达谱预测随后通过生物信息学在线网站预测人的HDAC11基因在乳腺癌中的表达谱情况，红色选取了1085个乳腺癌组织，黑色为选取了291个正常的乳腺组织，结果发现HDAC11在乳腺癌中异常表达，推测其在乳腺癌中发挥着作用。图5HDAC11在乳腺癌与正常乳腺细胞中的表达谱预测3.6人的HDAC11的序列分析人的组蛋白去乙酰化酶HDAC11在NCBI上的GenBank为BC009676.1，以下是HDAC11编码蛋白质的基因序列，其中标记的为限制性内切酶切位点EcoRI和XbaI，通过双酶切将其重组到载体pcDNA3.1载体上。碱基序列：GCTCTAGAATGCTACACACAACCCAGCTGTACCAGCATGTGCCAGAGACACGCTGGCCAATCGTGTACTCGCCGCGCTACAACATCACCTTCATGGGCCTGGAGAAGCTGCATCCCTTTGATGCCGGAAAATGGGGCAAAGTGATCAATTTCCTAAAAGAAGAGAAGCTTCTGTCTGACAGCATGCTGGTGGAGGCGCGGGAGGCCTCGGAGGAGGACCTGCTGGTGGTGCACACGAGGCGCTATCTTAATGAGCTCAAGTGGTCCTTTGCTGTTGCTACCATCACAGAAATCCCCCCCGTTATCTTCCTCCCCAACTTCCTTGTGCAGAGGAAGGTGCTGAGGCCCCTTCGGACCCAGACAGGAGGAACCATAATGGCGGGGAAGCTGGCTGTGGAGCGAGGCTGGGCCATCAACGTGGGGGGTGGCTTCCACCACTGCTCCAGCGACCGTGGCGGGGGCTTCTGTGCCTATGCGGACATCACGCTCGCCATCAAGTTTCTGTTTGAGCGTGTGGAGGGCATCTCCAGGGCTACCATCATTGATCTTGATGCCCATCAGGGCAATGGGCATGAGCGAGACTTCATGGACGACAAGCGTGTGTACATCATGGATGTCTACAACCGCCACATCTACCCAGGGGACCGCTTTGCCAAGCAGGCCATCAGGCGGAAGGTGGAGCTGGAGTGGGGCACAGAGGATGATGAGTACCTGGATAAGGTGGAGAGGAACATCAAGAAATCCCTCCAGGAGCACCTGCCCGACGTGGTGGTATACAATGCAGGCACCGACATCCTCGAGGGGGACCGCCTTGGGGGGCTGTCCATCAGCCCAGCGGGCATCGTGAAGCGGGATGAGCTGGTGTTCCGGATGGTCCGTGGCCGCCGGGTGCCCATCCTTATGGTGACCTCAGGCGGGTACCAGAAGCGCACAGCCCGCATCATTGCTGACTCCATACTTAATCTGTTTGGCCTGGGGCTCATTGGGCCTGAGTCACCCAGCGTCTCCGCACAGAACTCAGACACACCGCTGCTTCCCCCTGCAGTGCCCTGAGAATTCCGCDS序列：MLHTTQLYQHVPETRWPIVYSPRYNITFMGLEKLHPFDAGKWGKVINFLKEEKLLSDSMLVEAREASEEDLLVVHTRRYLNELKWSFAVATITEIPPVIFLPNFLVQRKVLRPLRTQTGGTIMAGKLAVERGWAINVGGGFHHCSSDRGGGFCAYADITLAIKFLFERVEGISRATIIDLDAHQGNGHERDFMDDKRVYIMDVYNRHIYPGDRFAKQAIRRKVELEWGTEDDEYLDKVERNIKKSLQEHLPDVVVYNAGTDILEGDRLGGLSISPAGIVKRDELVFRMVRGRRVPILMVTSGGYQKRTARIIADSILNLFGLGLIGPESPSVSAQNSDTPLLPPAVP根据以上CDS对应的碱基序列利用PrimerPremier5.0软件设计出的实验所需的引物是：HDAC11-F:GCTCTAGAATGCTACACACAACCCAHDAC11-R:CGGAATTCTCAGGGCACTGCAGGGGGAAHDAC11-HR：CGGAATTCTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGGGCACTGCAGGGGGAA（C端带有HA标签）3.7HDAC11载体的构建提取乳腺癌细胞MCF-7的总RNA，通过琼脂糖电泳显示三条清晰的28SrRNA、18SrRNA和5SrRNA泳带（图6），说明所抽提的总RNA样品符合质量要求，并且经过紫外分光光度仪检测，各样总RNA的OD260/OD280值在1.8-2.0之前。图6RNA的琼脂糖凝胶电泳图以总RNA为模板反转录成cDNA，再以cDNA为模板经PCR扩增获得约1060bp大小、含HA标签的HDAC1基因片段，与预期相符，再将其连接至pcDNA3.1质粒上，成功构建pcDNA3.1-HDAC1-HA过表达载体（图7）。图7HDAC11的PCR琼脂糖凝胶电泳图3.8HDAC11的测序结果将提取的pcDNA3.1-HDAC11-HA送往公司进行测序，结果见图（图8）。说明重组重组质粒构建成功。图8HDAC11的测序结果图3.9HDAC11的过表达结果将构建成功的质粒转染乳腺癌MCF-7细胞48h后，收集MCF-7细胞通过裂解后提取细胞中的蛋白样，WesternBlot结果见图（图9），结果显示转染质粒成功在乳腺癌细胞MCF-7表达，其中空载体作为对照。图9WB检测HDAC11在乳腺癌细胞中过表达结果

4讨论现如今诸如外科手术治疗、放疗、新辅助化疗、靶向治疗、内分泌治疗等，是治疗乳腺癌常见的治疗手段[14]。但乳腺癌的发病率及死亡率均逐年上升，所以需寻找更多的治疗方法。目前已发现有多种HDAC抑制剂（HDACls）对乳腺癌的增殖和迁移有抑制作用，HDACls主要包括环四肽类、羟肟酸类、苯酰胺类以及短链脂肪酸。在这四类HDACls之中，是广谱抑制剂的有环四肽类、羟肟酸类、和短链脂肪酸，可以将I、II家族所有的HDACs亚型抑制。能够选择性抑制I型HDACs中HDACI、HDACII、HDACIII以及部分II型HDACs为选择性抑制剂，本酰胺类是其代表之一[15]。在研究组蛋白去乙酰化酶HDAC11的研究中，