红心火龙果果皮甜菜红素提取工艺优化及其对氧化损伤修复作用研究

红心火龙果果皮甜菜红素提取工艺优化及其对氧化损伤修复作用研究【摘要】目的：优化红心火龙果果皮甜菜红素的提取工艺，研究甜菜红素对氧化损伤后斑马鱼的修复作用。方法：通过响应面试验优化红心火龙果果皮中甜菜红素提取工艺。测定谷胱甘肽（GSH）含量，建立氧化应激模型作为甜菜红素对氧化损伤的修复作用指标。利用微分脉冲伏安法测定，得到斑马鱼脑组织中多巴胺含量并使用ImageJ运动跟踪软件测量自发运动，考察甜菜红素对其神经毒性的修复作用。结果：采用响应面试验优化提取条件，得到最优条件为：乙醇浓度：55%，提取温度：37℃，总甜菜红素含量为12.8mg/100g。斑马鱼经过氧化应激造模后GSH平均含量为：234.4mg/100g，多巴胺含量为5624ng/g，自发活动表现为行为增强。0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L三组实验组的斑马鱼给药168h后GSH平均含量分别为258.8mg/100g、289.8mg/100g、365.8mg/100g，多巴胺含量分别为4255ng/g、4248ng/g、4060ng/g，自发行为表现为平静。结论：红心火龙果果皮甜菜红素对氧化损伤后的斑马鱼有修复作用。【关键词】红心火龙果果皮；甜菜红素；提取工艺；抗氧化活性；氧化应激修复作用；StudyonextractiontechnologyofbetacyaninsfromPitayapeelanditsrepairtooxidativedamage【Abstract】Objective:Optimizetheextractionprocessofbetacyaninsinredpitayapeelandinvestigatethereparativeeffectofbetacyaninsonoxidativedamageinzebrafish.Methods:Optimizetheextractionprocessofbetacyaninfromthepeelofredpitayafruitviaresponsesurfacemethodologyanddeterminetheoptimalextractionconditionsbasedonbetacyanincontent.Determinethecontentofglutathioneandinvestigatetheestablishmentofanoxidativestressmodelandthereparativeeffectsofbetacyaninonoxidativestress.Scanthedopaminecontentinzebrafishbraintissueusingdifferentialpulsevoltammetrytoevaluatethereparativeeffectsofbetacyaninonzebrafishneurotoxicity.MeasurespontaneousmovementsusingImageJmotiontrackingsoftware.Comparetheresultsobtained,andexaminethereparativeeffectsofbetacyaninonoxidativestress.Results:Byusingresponsesurfacemethodologytooptimizetheextractionconditions,theoptimalconditionsweredeterminedtobe:ethanolconcentrationof55%,extractiontemperatureof37°C,andatotalbetacyanincontentof12.8mg/100g.Afterundergoingoxidativestressmodeling,theaverageGSHcontentofzebrafishwas234.4mg/100g,andthedopaminecontentwas5624ng/g.Spontaneousactivitywasenhanced.Followingadministrationof0.2g/L,0.1g/L,and0.05g/Loftheextractfor168hours,theaverageGSHcontentofzebrafishinthethreeexperimentalgroupswas258.8mg/100g,289.8mg/100g,and365.8mg/100g,respectively.Thedopaminecontentinthethreeexperimentalgroupswas4255ng/g,4248ng/g,and4060ng/g,respectively,andspontaneousactivityappearedtobecalm.Conclusion:Betacyaninsfromtheredpitayafruitpeelhavearepairingeffectonzebrafishafteroxidativedamage.【Keywords】RedPitayapeel;Betacyanins;Extractiontechnology;Antioxidantactivity;Oxidativestressrepair目录TOC\o"1-3"\h\u1前言 前言甜菜红素（betacyanin）是水溶性色素，属于吡啶类衍生物，分为红色的甜菜红素（Betacyanins）和黄色的甜菜黄素（Betaxanthins）REF_Ref14782\r\h[1]。甜菜红素是一类含氮的天然色素，由甜菜醛氨酸和环-3,4-二羟基苯丙氨酸（cyclo-Dopa）共轭生成（如图1所示），甜菜醛氨酸的共轭双键部分构成发色团REF_Ref14835\r\h[2]；最常见的甜菜红素是甜菜苷（Betanin），即Betanidin-5-O-葡萄糖苷，为游离的Betanidin与葡萄糖结合形成的糖苷REF_Ref14946\r\h[3，4]。甜菜红素具有较高的亲水性和着色强度，因而可作为食品、药品及化妆品的重要且有效天然着色剂REF_Ref28885\r\h[4]。红心火龙果果皮中甜菜红素作为着色剂添加到相关食品中且由于其结构的特殊性，除着色作用外甜菜红素还可以作为天然抗氧化剂，其机制可能是通过增强肝细胞的抗氧化酶活性，降低脂质过氧化，并清除自由基来实现的[5]。图1甜菜醛氯酸（A）、cyclo-Dopa（B）、甜菜苷配基（C）、甜菜苷（D）的化学结构红甜菜根、红火龙果和红苋菜是甜菜红素的三大主要来源，据统计其中甜菜红素的含量范围为44-51mg/g冻干提取物[6]。其中在红皮火龙果果皮以及红皮红肉的果肉中均含有甜菜红素，值得注意的是，果皮占整果18%-24%，其甜菜红素含量为6-22mg/100g[7]，但果皮常被丢弃，故与此同时丢弃了大量甜菜红素资源。火龙果来源的甜菜红素有8种，其中甜菜苷（betanin）占比最大[8]。目前没有单一结构的甜菜红素标品，这在某种程度上制约了相关研究，其含量测定方法为大部分学者利用紫外可见分光光度计测量其在最大吸收波长下的吸光度值后计算[8,9]。用于火龙果源甜菜红素提取的方法有浸提法、微波辅助提取、超声波辅助提取、超临界萃取及双水相萃取，其中，采用乙醇浸提法的提取量最高，但浸提法耗时长，溶剂用量大，总体成本较高[10-14]。氧化应激是指机体在遭受各种刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)过量产生，超出机体的清除能力，致氧化和抗氧化状态失去平衡，进而引起组织氧化损伤[15]，是导致衰老、神经退行性疾病、癌症、高血压、阿尔茨海默病、帕金森病等疾病的重要因素之一[16-20]。而肝脏是生物代谢主要器官，其中谷胱甘肽含量丰富，毒害后会出现明显反应[21]。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是细胞内含量最丰富的低分子质量硫醇化合物，广泛分布于人的肝脏、脾脏、肾脏、肺等器官组织和细胞中[22]。GSH是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽（图2），其主要特点是具有游离的巯基（—SH），易受氧化，是两种酶GSH-PX和GST的底物，为分解水和过氧化物必需的，它可以稳定含硫醇基团的酶，并防止血红蛋白和其他辅因子的氧化损伤，GSH缺乏或耗尽可能会导致或加重许多化学物质或环境因素的中毒，GSH是哺乳动物细胞中的非酶类抗氧化剂，含量丰富，不仅是细胞内抵御氧化应激的重要机制，也是对抗ROS的重要抗氧化系统防御线，因而GSH的量的多少是衡量机体的重要因素[23]，谷胱甘肽的测量方法有比色法、HPLC法、荧光法等。图2谷胱甘肽结构式氧化应激是多巴胺功能细胞神经紊乱的重要原因[24]，是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质（图3），作为调控人类情绪和能力的重要物质，它在人类的运动功能中也发挥重要作用。许多研究表面，多巴胺的含量与中枢神经系统的多种退行性疾病有密切联系[25]，同时许多治疗疾病的有效药物也围绕着多巴胺的研究而产生。多巴胺作为中枢神经系统的重要神经递质，主要参与运动、情感和神经内分泌的调节，多巴胺系统是近30年来神经科学研究的焦点问题之一，一些疾病如帕金森病（PD）、精神分裂症、Tourette综合征（TS）、注意缺陷多动障碍（ADHD）等均与多巴胺能神经递质传递障碍有关[26]，检测多巴胺含量的方法有HPLC法、液相质谱联用和电化学分析法。图3多巴胺结构式关于体内氧化损伤的研究对象，陈晨[27]研究发现斑马鱼是一种常见的神经经损伤程度的重要因素科学模式生物，它拥有与人类类似的神经发育等特征，斑马鱼和人类的基因有着70%的同源性，且84%的人类疾病相关基因都能在斑马鱼组织中找到，作为主要模式生物之一被广泛应用于遗传学、发育生物学、神经生物学和药物筛进等科研领域，所以在对斑马鱼做出的实验结果也多适用于人体，可用于药物恢复性的研究及筛选关于斑马鱼氧化应激建模。较多学者是利用醋酸铅、AAPH、脂多糖对斑马鱼胚胎进行氧化胁迫的造模[28]，并进行了几种建模类型的比较。戊唑醇是一种三唑类杀菌农药，具有高效、广谱和内吸性的特点，该农药可实现植物的保护、治疗和铲除三种农药功能，并具备杀菌范围广、持续性强等显著的特性[29]。对于暴露在戊唑醇下的斑马鱼，则有氧化应激损伤[30]，且伴有神经毒性[31]，涉及氧化磷酸化、线粒体功能和脂质调节的受损。本实验将围绕着甜菜红素出发，利用响应面法优化提取红心火龙果皮甜菜红素提取的条件，以斑马鱼为实验对象，利用戊唑醇建立氧化应激模型，利用比色法测定斑马鱼肝脏谷胱甘肽含量作为氧化应激修复作用指标，利用电化学分析法测定斑马鱼大脑多巴胺含量；利用ImageJ斑马鱼运动行为学作为神经损伤修复作用指标[32]，研究甜菜红素的体内修复作用。2实验材料2.1试剂和仪器本实验所用试剂及仪器如下表1。表1仪器的型号及厂家名称型号/规格生产厂家电子分析天平ML-204梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司恒温水浴锅金坛市科析仪器有限公司烘箱ST-01佛山市顺德区柏吴金属制品有限公司紫外分光光度计UV-1750日本岛津公司离心机TD-WS/55湖南平凡科技有限公司电化学工作站CHI660E/CH上海辰华仪器有限公司无水乙醇分析纯广州化学试剂厂红心火龙果购于广州市小谷围街道南亭村市场戊唑醇农药生许（浙）0016拜耳股份公司谷胱甘肽试剂盒20220713南京建城生物工程研究所浓盐酸化学纯广州化学试剂厂二甲基亚砜分析纯天津市科密化学试剂有限公司2.2实验动物Tubingen品系斑马鱼：购于南京一树梨花生物科技有限公司。3实验方法3.1响应面法优化甜菜红素提取根据响应面分析法的原理，参考琚常鑫[4]设置响应面试验影响因素与水平，见表2。表2响应面试验影响因素水平与编码水平水平及编码-101A乙醇浓度（%）506070B提取温度（℃）405060C料液比（g/ml）1：51：12.51：20D提取时间（h）0.511.5称取红心火龙果果皮干燥粉末每份1g，分别按照响应面实验因素条件进行提取。3.2总甜菜红素的含量测定参考JiangH等REF_Ref28905\r\h[9]的方法，按式（1），采用紫外-可见分光光度法，计算其总甜菜红素含量（TotalBetacyaninsContent(TBC)）的相对含量。TBC=A538式中：MW=甜菜苷的摩尔质量(550gmol−1)，V=样品的体积(mL)，DF=稀释倍数，ε=甜菜苷的摩尔消光系数(65,000Lmol−1cm−1),L=液层厚度(1cm),W=粗提物重量(g).3.3氧化损伤模型的建立取50尾斑马鱼，分为5组放入培养皿中，每组10尾斑马鱼于1L溶液，分别置于戊唑醇商业制剂浓度为0.0mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L。暴露48h后记录每组的死亡个体数。3.3.1斑马鱼的运动行为学观察取每组5尾斑马鱼，每尾分别放入培养皿中。将斑马鱼转移至培养皿后，待其适应培养皿环境2-3分钟后，拍摄视屏长度为2min的动作捕捉画面。使用ImageJ运动跟踪软件以每秒25帧的速度测量游泳活动，在预定义的场地内捕捉游泳动作(一个场地对应一个孔洞，内径约为120毫米)REF_Ref7054\r\h[32]。对每个动画文件设置检测变量，以保证对所有幼鱼的最佳检测。随后，使用ImageJ软件对数据进行分析，并提供其移动距离和静止时间，以表征每个个体的游泳活动。将得到结果对比，记录实验数据。3.3.2斑马鱼组织多巴胺含量测定将需要解剖的斑马鱼放入冰水混合物中20-30分钟，观察斑马鱼不再活跃游动。将麻醉后的鱼置于泡沫板上，在斑马鱼眼部与尾部固定两根针。从斑马鱼的腹鳍开始，用解剖剪将斑马鱼腹部划开至头部，再沿着脊椎剪至尾部，向下剪至排泄孔，挑开腹部皮肤，可以清晰观察斑马鱼的内脏结构，如下图4。图4斑马鱼的内脏分布将表面皿清洁干净后滴入几滴生理盐水，后内脏团置于表面皿内生理盐水滴中，使用解剖针与镊子将内脏团分离，只取肝脏部分，将分离出的肝脏置于加入了生理盐水的离心管中。再将斑马鱼的头部剪下，使用眼科剪沿着脊椎向着斑马鱼两眼之间剪开，暴露出脑组织，使用解剖针将脑组织从颅骨中分离，分离后将脑组织置于加入了生理盐水的离心管中。将已放入肝组织或脑组织的离心管35摄氏度的恒温水浴，保证组织活性，放置待用。从离心管中取出制得的斑马鱼脑组织，用冰盐水漂洗，吸水纸吸干，称重记录数据后放入研磨钵中，加入适量的人工脑脊液，在冰水浴下手动研磨5min使组织匀浆化。将匀浆液倒入1.5mL离心管中，2500转/分，离心10分钟，取上清液进行测定。取1mL上述步骤制得的脑组织上清液于烧杯中，再加入19mL的人工脑脊液，将溶液混合均匀，等待测定。使用CHI660E电化学工作站，采用饱和甘汞电极参比电极、铂片对电极、制得的修饰碳纤维电极作为工作电极，使用差分脉冲伏安法(DPV)作为测定方法REF_Ref3029\r\h[33]，在起始电压为−0.3，终止电压为0.6V，脉冲振幅为50mV，脉冲宽度为0.2s，脉冲周期为0.5s的条件下测定，记录峰高REF_Ref18871\r\h[34]。实验最佳条件下，在pH=8.0的磷酸盐缓冲溶液中，调节扫描速率为10mv/s,从-0.4v—0.6v之间进行扫描，多巴胺的浓度在至1μg/L—3μg/L范围内与峰电流呈现良好的线性关系，以纵坐标为多巴胺浓度，横坐标为峰电流大小建立多巴胺含量标准曲线，电流单位为A，浓度单位为μg/L。按下列公式计算（2）斑马鱼脑组织中多巴胺含量。斑马鱼脑组织中多巴胺含量=溶液中多巴胺浓度*20*103.3.3斑马鱼肝组织谷胱甘肽含量测定从离心管中取出制得的斑马鱼肝组织，用冰盐水漂洗，吸水纸吸干，称重记录数据后放入研磨钵中，加入适量的匀浆递质，在冰水浴下手动研磨5min使组织匀浆化。将匀浆液倒入1.5mL离心管中，2500转/分，离心10分钟，取上清液进行测定。使用谷胱甘肽测定试剂盒进行斑马鱼肝脏组织谷胱甘肽测定，按照试剂盒说明书配置好需要的试液和标准品溶液（100μmol/LGSH）。于420nm处，1cm光径，测定各管吸光度值，以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，建立标准曲线。按照试剂盒说明书配置好需要的试液，准备上述步骤制得的肝脏组织匀浆液，开始测定。首先取10%肝脏匀浆液上清液0.5mL，与试剂盒中试剂一应用液2mL混匀，3500-4000转/分离心10分钟，取上清液1mL进行显色反应。在测定管中加入1mL上述步骤制得的肝组织上清液，与试剂盒中试剂二1.25mL，试剂三0.25mL，试剂四0.05mL混合均匀。在空白管加入试剂盒中试剂一应用液1.0mL，试剂二1.25mL，试剂三0.25mL，试剂四0.05mL。静置五分钟显色，使用紫外可见光光度计，在420nm处，1cm光径，双蒸水调零比色后测量各管OD值，平行测量三次，记录数据，所得OD值查标准曲线上所对应的浓度，并计算给药组与正常组肝脏中谷胱甘肽含量比值。按照3.3.1方法测定模型组斑马鱼的运动轨迹及其轨迹参数后与正常组斑马鱼相比较，比较数据；按照3.3.2和3.3.3的方法测定模型组斑马鱼的谷胱甘肽含量及其多巴胺含量进行比较，以上数据作为评价氧化应激模型建立成功与否的指标。确定氧化应激模型建立的给药浓度后，以此浓度给药，养殖96h，作为模型组备用。3.4甜菜红素的氧化应激修复作用取0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L作为三组实验组的给药浓度，1%的DMSO为溶剂，给药期为168h，每组1L，10尾斑马鱼。以1L1%DMSO养殖264h，10尾斑马鱼作为溶剂（DMSO）组。以1L蒸馏水养殖264h，10尾斑马鱼作为空白组。损伤96h后的实验组继续给予1%DMSO养殖168h，作为模型组。按照3.3.2方法测定实验组、空白组、溶剂组和模型组斑马鱼的运动轨迹及其轨迹参数，记录数据。按照3.3.2和3.3.3的方法测定实验组、空白组、溶剂组和模型组斑马鱼的谷胱甘肽含量及其多巴胺含量，记录数据，作为判断甜菜红素氧化应激修复作用的指标。4结果与讨论4.1响应面分析法优化甜菜红素的提取4.1.1响应面试验结果及分析在单因素的基础上，采用响应面方案进一步试验。结果见表3。表3响应面试验方案及结果编号No.A乙醇浓度/（%）B温度/（°C）C料液比/（0.01mL·g-1）D提取时间/（min）TBC(mg/100g)140300.125604.94260300.1256010.7340500.125602.86460500.125604.52550400.05305.87650400.2309.48750400.059011.5850400.29012.5940400.125303.871060400.125307.281140400.125907.591260400.1259011.71350300.05609.531450500.05605.261550300.26011.51650500.2605.861740400.05606.341860400.056010.71940400.2608.512060400.26012.32150300.125304.232250500.125303.032350300.1259010.02450500.125904.552550400.1256011.32650400.1256012.42750400.1256012.02850400.1256012.42950400.1256011.34.1.2响应面数学模型的建立与显著性检验用DesignExpert8.0.6分析软件建立方程：Y=11.94+1.94×A-2.08×B+0.9194×C+2.02×D-1.04×AB-0.1469×AC+0.1780×AD-0.3559×BC-1.07×BD-0.6444×CD-2.24×A2-4.03×B2+0.0216×C2-2.20×D2,模型的回归系数显著性检验及结果见图7。由模型的“P值”＜0.0001可知该回归方程模型达到了极显著的水平，可靠性较高；决定系数R2=98.71%；注：R2=0.9871,RAdj2图5模型回归系数显著性检验及结果4.1.3单因素交互作用由DesignExpert8.0.6分析软件得到最佳提取为乙醇浓度55%，温度37℃，料液比1：7.6g/mL，提取时间69min，甜菜红素的理论含量为12.8mg/100g。反应面更陡峭，意味着各个因素之间的相互影响更大，各因子相互作用等高线和曲面图在图6-11中显示。A:乙醇浓度B：温度图6乙醇浓度和提取温度对甜菜红素含量的等高线及曲面图由图6知，乙醇浓度一定时，甜菜红素含量随着提取温度的增加而增加，达到最大值后逐渐下降。且曲面陡峭、等高线偏向椭圆，说明乙醇浓度（A）和温度（B）之间交互作用较强。A：乙醇浓度C：料液比图7乙醇浓度和料液比对甜菜红素含量的等高线及曲面图由图7知，乙醇浓度一定时，甜菜红素含量随着料液比的增加而增加，达到最大值后逐渐下降。且曲面较为平淡，表面乙醇浓度（A）和料液比（C）之间的交互作用较弱。A:乙醇浓度D：提取时间图8乙醇浓度和提取时间对甜菜红素含量的等高线及曲面图由图8知，乙醇浓度一定时，甜菜红素含量随着提取时间的增加而增加，达到最大值后逐渐下降。且曲面陡峭、等高线偏向椭圆，说明乙醇浓度（A）和提取时间（D）之间交互作用较强。B：提取温度C：料液比图9提取温度和料液比对甜菜红素含量的等高线及曲面图由图9知，提取温度一定时，甜菜红素含量随着料液比的增加而增加，达到最大值后逐渐下降。且曲面陡峭、等高线偏向椭圆，说明提取温度（B）和料液比（C）之间交互作用较强。B：提取温度D：提取时间图10提取温度和提取时间对甜菜红素含量的等高线及曲面图由图10知，提取温度一定时，甜菜红素含量随着提取时间的增加而增加，达到最大值后逐渐下降。且曲面陡峭、等高线偏向椭圆，说明提取温度（B）和提取时间（D）之间交互作用较强。C：料液比D：提取时间图11液料比和提取时间对甜菜红素含量的等高线及曲面图由图11知，料液比一定时，甜菜红素含量随着提取时间的增加而增加，达到最大值后逐渐下降。且曲面较为平淡，表面料液比（C）和提取时间（D）之间的交互作用较弱。4.2氧化应激模型的建立如表4所示，当戊唑醇浓度为0.5mg/L死亡个体为0，致死率为0%，故使用0.5mg/L的戊唑醇作为我们的安全剂量组。表4戊唑醇给药浓度及其致死率戊唑醇浓度（mg.L）死亡数（尾）致死率（%）0.0000.5000.74401.07702.010100空白组、模型组斑马鱼2min内运动轨迹捕捉如图12所示。由运动轨迹可明显看出，在建模后斑马鱼自发行为轨迹明显混乱，产生明显行为增强。模型组的斑马鱼更喜爱想中央区域游动，活跃性较高；而空白组则相对安静，活跃性较低。从行为参数上分析，模型组静止时间为最短，即其运动最为活跃；空白组则相较静止时间长，即其运动更为安静。静止时间对比，空白组与模型组差异较显著，说明氧化应激模型建立成功。从移动距离上分析可知，模型组移动距离较长，处于活跃状态，与空白组相比，移动距离差异较显著。结果表明，模型组行为学上表现为明显行为增强。注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著;**与空白组相比，差异显著；p<0.01，差异高度显著；***与空白组相比，p<0.001，差异极显著A:空白组与模型组运动轨迹B：2min内运动距离对比及显著性差异C：2min内静止时间对比及显著性差异图122min内斑马鱼自发行为运动对比多巴胺含量标准曲线：多巴胺的浓度在至1μg/L-3μg/L范围内与峰电流呈现良好的线性关系(如图13)，回归方程为：，纵坐标为多巴胺浓度，横坐标为峰电流大小。电流单位为A，浓度单位为μg/L，相关系数r=0.9957。图13多巴胺含量标准曲线图将空白组与模型组斑马鱼解剖后，将脑组织按照“3.3.3斑马鱼脑组织多巴胺含量测定”方法检测，结果如表5和图14。对比可看出模型组多巴胺含量有较显著上升，说明建模后斑马鱼有神经损伤，氧化应激模型建立成功。表5不同组鱼的多巴胺峰电流与含量斑马鱼脑组织质量（mg）平均峰电流（10-6A）溶液中多巴胺浓度（μg/L）斑马鱼组织多巴胺含量（ng/g）空白组10.62.0282.0684595模型组10.32.3892.5315624注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著;**与空白组相比，差异显著；p<0.01，差异高度显著；***与空白组相比，p<0.001，差异极显著图14模型组与空白组多巴胺含量对比图谷胱甘肽含量标准曲线：如图16所示，谷胱甘肽标准曲线方程为y=0.0038-0.0021，r=0.9987，拟合程度较好。空白组与模型组肝组织中GSH含量如图15所示，可明显看出模型组斑马鱼肝组织内GSH含量明显下降，说明建模后斑马鱼肝脏存在明显氧化应激损伤，该模型可应用于后续实验。A:GSH含量标准曲线图B:GSH含量对比图图15GSH含量图4.3甜菜红素的氧化应激修复作用空白组、溶剂（DMSO）组、实验组、模型组组斑马鱼2min内运动轨迹捕捉如图16,17所示。模型组的斑马鱼更喜爱想中央区域游动，活跃性较高；而实验组则相对安静，活跃性较低。由图中可知，模型组运动距离最长，且其运动距离显著高于空白组，说明其有明显行为增强，实验组运动距离与空白组无明显差距，说明甜菜红素对斑马鱼氧化应激造成的行为增强有明显修复作用。模型组静止时间为最短，即其运动最为活跃，且模型组静止时间与空白组相比显著降低；实验组静止时间最长，即其运动最为安静，且其静止时间与空白组相比无明显差异，说明甜菜红素对氧化应激有明显修复作用。结果表明，正常组的斑马鱼活动规律正常，匀速平缓在观察孔中游动，戊唑醇导致斑马鱼行为增强，给予甜菜红素则会使斑马鱼有所恢复。另外，溶剂（DMSO）组与正常组无明显差异，可以认为溶剂毒性不会影响实验结果。A:空白组B:模型组C:溶剂（DMSO）组D：0.05g/L组E:0.1g/L组F:0.2g/L组图162min内斑马鱼运动轨迹注：*与空白组相比，p＜0.05;**与空白组相比，p<0.01；***与空白组相比，p<0.001；ns与空白组相比，p>0.05A:斑马鱼运动距离对比B:斑马鱼静止时间对比图172min内斑马鱼自发行为运动数据对比将空白组、模型组和溶剂（DMSO）组和实验组（0.05g/L）斑马鱼解剖后，将脑组织按照“3.3.2斑马鱼脑组织多巴胺含量测定”方法检测，结果如图18。由数据可知，三组实验组组给药后多巴胺浓度均恢复至正常水平，说明给药可以缓解其氧化应激所导致的神经毒性作用。另外，溶剂（DMSO）组与正常组无明显差异，可以认为溶剂毒性不会影响实验结果。图18空白组、模型组和溶剂（DMSO）组和实验组多巴胺含量对比图给予0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L甜菜红素浓缩物养殖后的斑马鱼、空白组、溶剂（DMSO）组和毒性组肝脏中GSH含量如图19所示，模型组相较于空白组GSH含量显著下降，给药后明显恢复，且剂量越高恢复作用越好。0.2g/L剂量组与正常组之间不存在显著差异，可以认为基本上恢复到正常水准。说明甜菜红素给药后可以起到明显的氧化应激修复作用。另外，溶剂（DMSO）组与正常组无明显差异，可以认为溶剂毒性不会影响实验结果。图19斑马鱼GSH含量对比及显著性检测注：*与空白组相比，p＜0.05，差异较显著;**与空白组相比，差异显著；p<0.01，差异高度显著；***与空白组相比，p<0.001，差异极显著5结论采用响应面法得到最佳提取为乙醇浓度55%，温度37℃，料液比1：7.6g/mL，提取时间69min，此条件下甜菜红素的平均含量为12.8mg/100g。模型组斑马鱼自发行为更为频繁，其运动参数皆高于空白组，呈差异显著，说明戊唑醇可造成斑马鱼行为增强，氧化应激模型建立成功。模型组多巴胺含量相较于空白组增加，说明戊唑醇有神经毒性作用。模型组斑马鱼谷胱甘肽含量明显低于正常组，模型组与空白组GSH含量存在显著性差异，说明以戊唑醇喂养斑马鱼建立氧化应激模型效果好。模型组斑马鱼肝组织GSH含量显著低于空白组，实验组GSH含量与空白组无显著性差异；斑马鱼脑组织中模型组的多巴胺含量略高于空白组，实验组给药后皆恢复到与空白组无显著差异；模型组斑马鱼自发运动静止时间显著低于其他组，自发运动距离显著高于其他组，实验组皆与空白组无显著性差异，说明红心火龙果果皮甜菜红素对氧化损伤有修复作用，且0.2g/L为红心火龙果果皮甜菜红素最有效剂量。参考文献CelliGB,BrooksMS.Impactofextractionandprocessingconditionsonbetalainsandcomparisonofpropertieswithanthocyanins-Acurrentreview[J].FoodResearchInternational,2017,100:501-509.Rodriguez-AmayaDB.Updateonnaturalfoodpigments-Amini-reviewoncarotenoids,anthocyanins,andbetalains[J].FoodResearchInternational,2019,124:200-205.AzeredoHMC.Betalains:properties,sou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