课件速览-人干扰素α2b的疏水层析

项目三人干扰素α2b的生产任务五人干扰素α2b的疏水层析取经离子交换层析纯化后的洗脱液为原料，以OctylSepharose4FF为填料开展疏水层析操作，制得纯度更高的人干扰素α2b料液。规范填写生产记录。任务学习路径见思维导图。任务描述人干扰素α2b的疏水层析2任务支撑（一）人干扰素α2b疏水层析的目的与作用

疏水层析（HIC）和反相层析（RPC）都是基于料液中物质分子的疏水基团与层析介质上的疏水基团发生吸附作用，在非极性的固定相和极性的流动相之间不断分配而分离的技术。

本任务以Octyl疏水填料，去除料液中与人干扰素α2b的疏水性有差异的杂质，提高人干扰素α2b纯度。人干扰素α2b的疏水层析疏水基团3（二）疏水层析

疏水层析（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）是利用表面偶联弱疏水基团（疏水性配基）的吸附剂为固定相，根据物质与疏水吸附剂之间可逆的疏水性相互作用差别，在相对温和的条件下进行生物分子分离与纯化的层析法。适用于在药物生产的中度纯化阶段；可用于捕获和精制阶段；适用作盐析后的后续工序（在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大）4（二）疏水层析

2.疏水层析介质

疏水层析介质呈球状，一般以刚性的、大孔的、载量大的惰性支撑骨架作基质。利用氨基或醚键把基质与发挥疏水性吸附作用的配基偶联。

基质为Sepharose琼脂糖、硅胶、聚苯乙烯和联乙烯苯等有机聚合物。

疏水配基主要为烷基和芳香基，其烷基通常不多于C8（如丁基、辛基和新戊基等），芳香基多为苯基5（二）疏水层析

2.疏水层析介质常见的疏水层析配基丁基硫醚正丁烷基异丙基正辛烷基苯基基团的疏水性自左向右增强6（二）疏水层析3.疏水层析技术机制

疏水作用是指水中蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子内部，有聚集在一起形成最小疏水面积的趋势。尽管蛋白质将疏水基团折叠在分子内部而表面显露极性，但是仍会有一些疏水基团或疏水部位暴露在蛋白质表面，苯丙氨酸和酪氨酸等疏水性氨基酸含量越大的蛋白质，疏水性越强。溶菌酶示意（深色表示亲水性氨基酸，浅色表示疏水性氨基酸）（1）疏水层析机制7（二）疏水层析3.疏水层析技术机制溶菌酶示意（深色表示亲水性氨基酸，浅色表示疏水性氨基酸）（1）疏水层析机制盐析作用解释疏水层析蛋白质在离子强度较高的盐溶液中，表面水化层受破坏，露出疏水部位，疏水相互作用增大；相应地，随着盐浓度降低，疏水相互作用减弱。疏水层析中上样吸附蛋白质是在高浓度盐溶液中进行洗脱是通过降低流动相离子强度实现缓冲液中离子强度降低，疏水性弱的蛋白质先被洗脱。盐浓度降得更低时有较强疏水相互作用的蛋白质被洗脱。8（二）疏水层析3.疏水层析技术机制（2）影响疏水层析的因素PO43-，S042-，CH4COO-，C1-，Br-，NO3-，ClO4-，I-，SCN-NH4+，Rb+，K+，Na+，Cs+，Li+，Mg2+，Ca2+，Ba2+①离子强度及种类促进疏水作用破坏疏水作用疏水层析中常用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠9（二）疏水层析3.疏水层析技术机制（2）影响疏水层析的因素②破坏水化作用的物质③降低表面张力的化学物质。表面活性剂可以与蛋白质的疏水部位结合，减弱蛋白质与固定相的疏水性吸附。难溶于水的膜蛋白可以添加一定量的表面活性剂使其溶解，有利于洗脱。加入乙二醇等多元醇可改变流动相的表面张力，降低疏水作用，有利于层析展开、洗脱。④pH。一般pH升高会使疏水作用减弱，而降低pH则可增加疏水作用。但是，一些等电点较高的蛋白质，在高pH情况下会牢固地结合到固定相上，低pH有利于洗脱。⑤温度。疏水吸附结合作用随温度升高而增大，降温有利于洗脱。SCN-、ClO4-和I-等离子半径较大、电荷密度低10（二）疏水层析4.疏水层析操作技术

疏水层析技术操作主要包括装柱阶段、平衡阶段、上样阶段、洗涤阶段、洗脱阶段、清洗和再平衡阶段。11（二）疏水层析洗脱：生产中主要采用降低盐浓度的方法进行洗脱。4.疏水层析操作技术（a）疏水层析线性梯度洗脱层析12（二）疏水层析洗脱：生产中主要采用降低盐浓度的方法进行洗脱。4.疏水层析操作技术（b）疏水层析阶梯洗脱层析13（三）反相层析1.反相层析的应用反相层析与疏水层析主要区别：疏水侧链的长度及其在介质骨架上的密集程度不同，疏水层析的疏水性较弱，反相层析的疏水性较强。

反相层析常需要较高的操作压力，需要加入有机溶剂进行洗脱，易导致蛋白质四级构象发生变化而变性，因此在工业生产中应用受限。

适用于肽类、寡核苷酸等小分子，还可用于纯化变性后可复性的重组、合成蛋白质等，还可用于样品浓缩、脱盐。2.反相层析的介质

反相层析介质的疏水基团密集程度比疏水层析介质要高得多，并且常使用长脂肪链如十八碳烷烃作为功能基，疏水性更强。疏水层析以八碳烷烃为主要代表，且密集程度小，使目的物能以较温和条件纯化。而反相层析中功能基团的疏水性要比疏水层析固定相高几十倍到几百倍。14（三）反相层析

反相层析技术操作主要包括装柱阶段、平衡阶段、上样阶段、洗涤阶段、洗脱阶段、清洗和再平衡阶段。3.反相层析操作技术15（三）反相层析3.反相层析操作技术（1）装柱阶段

反相层析介质装填要致密、均匀、无气泡，减少样品流动过程中的展宽，提高物质分辨率。（2）平衡阶段（5倍柱床体积）

起始缓冲液（标识为：A溶液）一般为加入一定比例有机溶剂的水溶液，通常带有三氟乙酸（TFA）等离子对试剂和离子效应抑制剂来促进疏水相互作用，还可加有低浓度有机修饰剂，如5%乙腈。（3）上样阶段

必要时，先采用凝胶层析柱，更换样品缓冲溶液、脱盐和除去低分子量杂质后再上样。

样品溶解于起始平衡缓冲液。样品需澄清，否则需用滤纸或5μm滤膜过滤，然后再采用10000g离心10min，或者0.22μm孔径微孔滤膜过滤。

上样量为层析剂介质总结和能力的20%～25%。16（三）反相层析3.反相层析操作技术（4）洗涤阶段

上样后继续用起始平衡缓冲液冲洗层析柱，至层析图基线稳定，液体用量约2倍柱床体积。（5）洗脱阶段

增加有机修饰剂浓度，如逐渐提高乙腈浓度比例至80%B溶液，结合物被洗脱下来。疏水性弱的结合物先被洗脱下来，强的后被洗脱下来。（6）清洗和再平衡段①用至少5CV的100%B溶液冲洗--除去仍结合的分子②用2～3CV从100%B溶液到0%B溶液梯度--避免成分突然改变损坏柱子③用至少10CV起始缓冲液--再平衡如有难以清洗的结合物，可考虑改换用疏水层析。17（四）有机溶剂安全1.使用有机溶剂存在的隐患12345易挥发引起火灾或爆炸过量储存或储存不当通风排气系统不符合要求使用非防爆电气设备有机溶剂致人员中毒！18（四）有机溶剂安全2.有机溶剂安全使用技能（1）有机溶剂的储存容器应尽可能密闭，杜绝跑冒滴漏，减少挥发气体散发，尽量防止外部空气进入设备容器内形成爆炸性气体混合物。（2）车间与仓库需设置消除静电设施，并使用防爆灯具、电气开关。（3）加强环境通风换气，对车间实行全面通风，合理设置排风设备，有效降低环境内有机溶剂气体的浓度。（4）专门的仓库内存储有机溶剂，避免日光直射和高温环境，远离火源和氧化剂。（5）以低毒（无毒）溶剂替代高毒（低毒）溶剂，对使用易燃易爆物岗位设立应急报警装置和应急救援设施。19（四）有机溶剂安全2.有机溶剂安全使用技能（6）熟读化学品安全技术说明书（MSDS），采取有针对性的安全措施。MSDS在国际上称作化学品安全信息卡，是化学品生产商和经销商按法律要求必须提供的化学品理化特性（如pH值，闪点，易燃度，反应活性等）、毒性、环境危害、以及对使用者健康（如致癌，致畸等）可能产生危害的一份综合性文件。20任务实施人干扰素α2b的疏水层析12345生产前准备装柱67平衡上样洗脱再生清场211.确认与填写检查记录

确认是否有前批清场合格证副本，确认生产环境、卫生和设备器具是否符合要求。填写发酵液中菌体的处理产前检查记录。2.领料与溶液配制领取生产用试剂耗材物料并配液：（1）平衡液：1mol/L硫酸铵的pH4.5，20mmol/LHAc-NaAc溶液。（2）洗脱液：含0.03mmol/L硫酸铵的pH4.5，100mmol/LHAc-NaAc溶液。（一）生产前准备22（二）装柱

如未装柱，则按标准操作规程将OctylSepharose4FF进行装柱，如已装好柱，则可顺序进行如下操作。23（1）洗脱，洗脱液流速为30.0mL/min，收集OD280＞0.2洗脱峰。（2）测量收集液OD280、OD260之值，比值应大于1.70。（3）目标蛋白纯度应＞95%，并计算收率。（4）洗脱液进行凝胶层析或于4℃放置不超过96h。（五）洗脱（1）预热紫外检测仪及记录仪，30min。（2）注射用水中，流速为30.0mL/min，冲洗3倍柱床体积。（3）平衡液平衡3倍柱床体积，至流出pH为4.5～5.0。（三）平衡（1）样品预处理。在DEAE柱洗脱液中加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为1mol/L，静置半小时以上。（2）上样。以30.0mL/min流速上样。上样后，用平衡液平衡2倍柱床体积。流速为30.0mL/min。（四）上样24（七）清场

检查、整理各项记录。规范地存放生产用试剂，清洗器具，维护设备，处置废物和废液，清洁、消毒工作台和洁净室。最后，填写清场合格证。注意：请在任务实施过程中规范填写《人干扰素α2b疏水层析操作记录》，不可补填和篡改！（1）将进液管换至注射用水中，调节泵流速为30.0mL/min，洗脱2倍柱床体积。（2）将进液管换至0.5mol/LNaOH清洁液中，调节泵流速为30.0mL/min，洗脱2倍柱床体积。（3）关闭泵、出液端夹子、记录仪和紫外检测仪。（六）再生25知识学习反思与反馈学习成果实践操作考核与评价26拓展任务疏水层析法纯化蛋白质27查阅资料，结合生活常识了解鸡蛋清组成及性质。查阅设计《疏水层析法纯化蛋白质操作记录》，在任务实施过程中同步填写。取鸡蛋蛋清，盐析法分别制得蛋白质溶液，再用疏水层析法分离蛋白组分，并检测分离的效果。设计实操设计（一）任务描述28（二）实训材料1.材料、试剂新鲜鸡蛋、上样缓冲液（20mmol/L，pH7.0磷酸钠盐，50％硫酸铵溶液）、硫酸铵。2.仪器设备5mLHiTrapPhenylHP预装层析柱（预填充有5mLPhenylSepharose6FF填料）、5mL注射器、50mL注射器或层析系统、高速冷冻离心机、0.22μm滤膜与滤器、紫外分光光度计。29（三）实训操作生产前准备样品的制备疏水层析柱平衡蛋白质溶液上样层析柱的洗涤蛋白质组分的洗脱层析柱的清洗与再生层析柱的保存12345678检测和分析910清场30（四）任务分析与总结（1）任务中采用的Hi