蛋白质的纯化与鉴定

关于蛋白质的纯化与鉴定LectureOutline蛋白质的分离纯化的基础蛋白质的分离纯化原则和程序蛋白质的含量测定蛋白质纯度鉴定蛋白质的分离纯化方法蛋白质层析技术蛋白层析的主要技术4/7/20242第2页,共110页，2024年2月25日，星期天第七部分蛋白层析的主要技术第3页,共110页，2024年2月25日，星期天蛋白层析的主要技术GelFiltrationChromatography(GFC)IonExchangeChromatography(IEXorIEC)AffinityChromatography(AC)HydrophobicInteractionChromatography(HIC)4/7/20244第4页,共110页，2024年2月25日，星期天I.GelFiltrationChromatography（GFC）第5页,共110页，2024年2月25日，星期天GelChromatography凝胶过滤（gelfiltration）(Porath,Flodin,1959)分子筛层析（molecularsievechromatography）(Hjertén,Mosbach,1962)排阻层析（exclusionchromatography）(Pedersen,1962)

指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。Gelfiltrationisatechniqueofliquidchromatographywhichseparatesmoleculesaccordingtotheirsizes.第6页,共110页，2024年2月25日，星期天基本原理凝胶层析的数理关系凝胶层析的优点凝胶层析的缺点凝胶介质凝胶类型的选择其它条件选择Gelfiltration第7页,共110页，2024年2月25日，星期天一、基本原理

样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出

分子筛效应分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。第8页,共110页，2024年2月25日，星期天（一）纯化：对生物大分子的纯化。如病毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核酸和多糖等。应用：第9页,共110页，2024年2月25日，星期天Gelfiltrationpurificationofanenzyme:

SDSanalysisM-LMWmarkers1-Startmaterial2-Poolfromionexchange3-PoolfromHIC4-PoolfromSuperdex75pg4321MM67k43k30k第10页,共110页，2024年2月25日，星期天（二）分子量的测定：球形蛋白质的洗脱体积主要是由它的分子量决定的，在一个相当的分子量范围内，洗脱体积大约是分子量对数的线性函数。用相同形状的和已知的蛋白质作出一条校正曲线，测定洗脱体积后可从校正曲线得到分子量。第11页,共110页，2024年2月25日，星期天Highlyefficientdesaltinginlessthan1minute

（三）溶液的浓缩：加入干胶，溶液的水和小分子被膨胀的凝胶吸收。（四）去除干扰的小分子：脱盐（盐可被看作是小分子）、EDTA、生物标记等。1020304050secAlbuminNaCl第12页,共110页，2024年2月25日，星期天（五）更换缓冲液：为接下来的实验更换缓冲液体系（六）测定平衡常数：例如药物的蛋白结合率。药物本身分子量较小，与蛋白结合后成为分子量较大的物质，通过凝胶过滤将二者分开。第13页,共110页，2024年2月25日，星期天二、凝胶层析的数理关系

1、柱床体积(VT)

2、洗脱体积（Ve）即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的总体积。3、外水体积（V0）4、内水体积（Vi）5、凝胶干体积（Vg）6、分配系数（Kd）

第14页,共110页，2024年2月25日，星期天柱床体积VT凝胶干体积Vg内水体积Vi存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的体积。颗粒内部所含水相的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量相减求得。凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。

VT=1/4

D2h外水体积V0VT=Vg+V0+Vi数理关系VoidvolumeVoVolumeofthegelmatrixVgPorevolumeVi第15页,共110页，2024年2月25日，星期天洗脱体积VeVoVeVolumeConcentration第16页,共110页，2024年2月25日，星期天

Ve-VoKd=————Vi分配系数（Kd

）：特点：（1）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关（2）与柱的长短粗细无关

每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（Kd）Ve=Vo+KdViKdisdifficulttogetbecauseViisdifficulttomeasure第17页,共110页，2024年2月25日，星期天(3)Ve=Vo+ViKd=1分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1,最后流出.(1)Ve=VoKd=0分子完全被排阻于凝胶颗粒之外全部分布于流动相里,最先流出。(2)0<Kd<1Ve=Vo+ViKd为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散

Kd=0

0＜Kd<1

Kd=1洗脱体积第18页,共110页，2024年2月25日，星期天

三.凝胶层析的优点

1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。凝胶本身不与样品发生化学反应。

2.操作条件较温和。用来分离一些理化性质不稳定的物质。

3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化。4.最快的更换缓冲液第19页,共110页，2024年2月25日，星期天四、凝胶层析的缺点1.要求样品和洗脱液的粘度很低。2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。如芳香族化合物与脂蛋白等。第20页,共110页，2024年2月25日，星期天葡聚糖（glucose）琼脂糖（agarose）聚丙烯酰胺（acrylamide）纤维素（cellulose）五、凝胶介质第21页,共110页，2024年2月25日，星期天

1959年Porath和Flodin合成（商品名为Sephadex）（1）结构：基本骨架：葡聚糖（dextran）交联剂：3-氯代-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构。1.葡聚糖凝胶第22页,共110页，2024年2月25日，星期天（2）特点：交联度：交联剂越多，交联度越大，网孔结构越紧密。孔隙愈小，吸水后膨胀也愈小，机械强度高，分离物质的分子量也小。反之,交联剂的百分比低，分离物质的分子量大。化学性质：

稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机溶剂,耐热耐碱不耐强酸第23页,共110页，2024年2月25日，星期天Sephadex的分级范围

G10<700G15<1,500G251,000~5,000G501,500~30,000G753,000~70,000G1004,000~150,000G1505,000~400,000G2005,000~800,000吸水性G类的型号表示每克干凝胶吸水量（ml）x10如G-50

每克干凝胶吸水量为5ml。第24页,共110页，2024年2月25日，星期天由琼脂制成的线性多糖，由D-半乳糖和3，6-脱水L-半乳糖交替组成。大孔凝胶，工作范围的下限几乎是Sephadex的上限，可分离MW40万以上的物质，可用来分离核酸及病毒琼脂糖凝胶不带电荷，不受微生物作用而降解对实验条件要求高(温度＜40℃,pH=4.5-9.0)2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose，Biogel-A)第25页,共110页，2024年2月25日，星期天型号

近似的琼脂糖浓度(%)多糖

蛋白质

Sepharose2B

220×106

40×106Sepharose4B45×106

20×106Sepharose6B61×106

4×106第26页,共110页，2024年2月25日，星期天是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似，但化学性质较葡聚糖稳定，可在pH2-11范围内使用.3、聚丙烯酰胺凝胶第27页,共110页，2024年2月25日，星期天■各种层析胶体：PharmaciaSephadexSepharoseSephacrylSephacelglucoseagaroseglucose+acrylamidecelluloseBio-RadBioGelPBioGelAacrylamideagarose第28页,共110页，2024年2月25日，星期天

1.组分离：当两种成分分子量差距很大时采用，例如脱盐。凝胶选择使高分子量的洗脱体积在外水（Vo），低分子量的洗脱体积接近Vt。脱盐一般推荐SephadexG-25。2.分级分离：当分离几种分子量接近的组分时，避免几种成分的洗脱体积接近Vo或Vt。3.分子量测定：要使样品分子量落在选择性曲线的线性部分及处于校正标准品的中间。一般推荐使用SephacrylS-200superfine,SephacrylS-300superfine或SepharoseCL-6B。六、凝胶类型的选择第29页,共110页，2024年2月25日，星期天七.其它条件选择

1.柱的选择

长的层析柱分辨率要比短的高。但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过1m，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。2.样品的选择：样品体积占床体积的1-5%,粘度小。

3.洗脱液的选择：完全不带电荷的物质可以用蒸馏水洗脱。带电荷的物质可以用Tris-HCl、磷酸盐缓冲液，最重要的要考虑洗脱液对样品的作用，如pH、离子强度、清洁剂等，是否会引起蛋白分解，影响酶、辅酶、激素的活性。第30页,共110页，2024年2月25日，星期天

八、凝胶过滤的实验（一）、凝胶的准备

Sephadex干粉状，用前需要膨胀，一般用蒸馏水进行，注意不要用电磁搅拌，以免破坏凝胶颗粒。不同类型的凝胶膨胀的时间不同：

G-25,G-50膨胀过夜

G-75一天

G-100二天

G-200三天在沸水中膨胀可缩短时间，并可除去气体。

Sephacryl,Sepharose,SepharoseCL是膨胀好的。第31页,共110页，2024年2月25日，星期天

（二）、装柱将凝胶悬液调成大约75%。用负压泵脱气。如果是加热后或冰箱中取出，要放置达室温。层析柱放置在避免过度通风和阳光直射的地方，防止温度变化。排掉层析床支持物内的气体。层析柱调到垂直位置。凝胶悬液要一次倒入柱内，避免分层。第32页,共110页，2024年2月25日，星期天

（三）、检查层析柱以蓝葡聚糖2000（2mg/ml）为样品，观察色带在柱内洗脱时移动的形状判断层析柱的质量，同时其洗脱体积又可作为外水体积。（四）、加样

1.手工加样

2.加样阀加样要求进入凝胶的样品前缘在同一水平。（五）、洗脱洗脱装置用蠕动泵将洗脱液泵入层析柱。要注意洗脱液的供给，不要走干，一旦走干，层析柱必须重新装才能使用。（六）、凝胶的清洗凝胶在使用数次后，一些杂质会吸附到上面，影响分离效果，需清洗后才能恢复原样。

Sephadex,，Sepacryl，SepharoseCL可用0.2MNaOH。

Sepharose可用4<pH<9缓冲液及非离子清洁剂。第33页,共110页，2024年2月25日，星期天

(七)、凝胶的储存和防止微生物生长使用中的柱子里，因为有缓冲液的不断流动，微生物不易生长，未用的柱子和放在容器中的凝胶悬液要采用抗菌剂预防微生物的生长，抗菌剂必须不与样品作用。通常用的防腐剂有：叠氮钠0.02%，三氯丁醇0.05%，硫柳汞0.005%，洗必太0.002%，汞苯盐（乙酸:硝酸）0.001-0.01%。

Sephadex,，Sephacryl,，Sepharose和SepharoseCL都可以在加防腐剂后以膨胀状态储存。最好在4℃冷藏，但要防止冻结，因为冻结将破坏凝胶颗粒。

Sephadex可以干燥后储存，干燥的程序是彻底清洗胶，除掉盐和杂质，去掉多余的水分以后，先加入稀的乙醇，平衡后，换稍浓一些的乙醇，依次增加乙醇的浓度，最后用96%乙醇，使胶皱缩，布氏漏斗抽虑，60-80℃烘干。第34页,共110页，2024年2月25日，星期天II.IonExchangeChromatographyUsefulatallstagesofpurificationandatallscales第35页,共110页，2024年2月25日，星期天基本原理离子交换剂的类型离子交换剂与缓冲液的选择应用离子交换层析的优点IonExchangeChromatography第36页,共110页，2024年2月25日，星期天一、原理用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离离子型混合物的层析方法。第37页,共110页，2024年2月25日，星期天低盐高盐分离结束第38页,共110页，2024年2月25日，星期天带电荷不同蛋白在特定pH值下有不同带电性质第39页,共110页，2024年2月25日，星期天离子交换树脂如何分离蛋白质洗脱树脂与树脂结合力第40页,共110页，2024年2月25日，星期天二、离子交换剂的类型在惰性载体上引入带有电荷的活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂——

带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂——带正电荷，与阴离子交换Ø

阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。胶体胶体第41页,共110页，2024年2月25日，星期天阳离子交换基强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂第42页,共110页，2024年2月25日，星期天阴离子交换基强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素第43页,共110页，2024年2月25日，星期天

基质电荷基团反离子商品名纤维素—O—CH2——COO-

·Na+CM-纤维素纤维素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2·Cl-DEAE-纤维素聚苯乙烯—————SO3-·

Na+732阳离子树脂

聚苯乙烯——N+（CH2）4·Cl-717阴离子树脂第44页,共110页，2024年2月25日，星期天离子交换树脂离子交换纤维素离子交换凝胶（二）按载体种类不同第45页,共110页，2024年2月25日，星期天1.离子交换树脂：聚苯乙烯树脂：苯乙烯二乙烯苯聚苯乙烯母体交联剂第46页,共110页，2024年2月25日，星期天离子交换树脂的性质1、一般离子交换剂的特性多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂稳定性：离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团第47页,共110页，2024年2月25日，星期天Dowex100149

mDowex50297

mDowex20840

m

2、交联度：

合成树脂时所用的交联剂在原料总重量中所占的百分比交联度越大树脂的网孔越小膨胀性小交换量少交联度越小树脂的网孔越大膨胀性大交换量大

膨胀性增加易引起树脂的机械变形破损第48页,共110页，2024年2月25日，星期天阳离子交换树脂

强酸型磺酸基

-SO3-H+

中等酸型磷酸根

-O-PO2H2

亚磷酸根-O-POH2

弱酸型羧基-COOH阴离子交换树脂

强碱季胺基团[-N+(CH3)3]

弱碱叔胺、仲胺、伯胺基团

可引入的解离基团第49页,共110页，2024年2月25日，星期天操作过程：

1.装柱；

2.离子交换；

3.洗脱第50页,共110页，2024年2月25日，星期天三、离子交换剂与缓冲液的选择（一）离子交换剂的选择必须考虑的影响因素1．阴、阳离子交换剂的选择2．强、弱离子交换剂的选择3．不同离子型交换剂的选择4．不同基质离子交换剂的选择第51页,共110页，2024年2月25日，星期天阴、阳离子交换剂的选择测定pI确定稳定pH范围碱性分子在偏酸性环境中稳定：细胞色素c

酸性分子在偏碱性环境中稳定：核酸、HCG第52页,共110页，2024年2月25日，星期天离子交换剂的选择图第53页,共110页，2024年2月25日，星期天不同离子型交换剂的选择选用何种类型离子交换剂?取决于离子交换剂对诸反离子的结合力。为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。第54页,共110页，2024年2月25日，星期天不同基质离子交换剂的选择1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小

大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素第55页,共110页，2024年2月25日，星期天1、缓冲液pH的选择

2、缓冲液离子组成的选择3、缓冲液离子强度的选择（二）缓冲液的选择第56页,共110页，2024年2月25日，星期天1、缓冲液pH的选择

①要求：起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来。②pH值与目标物pI的关系（pH=pI±1）③选用弱阳离子交换剂时，pH高于其pK；选用弱阴离子交换剂时，pH低于其pK；第57页,共110页，2024年2月25日，星期天2、缓冲液离子组成的选择①采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液，如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐②采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，如：Tris③缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、溶解度。第58页,共110页，2024年2月25日，星期天3、缓冲液离子强度的选择①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，一般小于0.1mol/L。②洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般0.15mol/L（或采用pH洗脱）。第59页,共110页，2024年2月25日，星期天

原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团

改变pH或离子强度

增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力洗脱方式：梯度洗脱(三)洗脱剂的选择第60页,共110页，2024年2月25日，星期天四、应用

分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及他带电的生物分子。第61页,共110页，2024年2月25日，星期天五、离子交换层析的优点应用范围广：20种氨基酸中，大部分带正电或负电。处理量大，附载系数高，一步缩小样品体积很多。去除杂质能力强，如对核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及电荷性有差别的蛋白均可去除。分离能力强。可放在纯化工艺的任何一步。第62页,共110页，2024年2月25日，星期天III.AffinityChromatography(AC)

亲和层析

第63页,共110页，2024年2月25日，星期天亲和层析ACAffinitychromatographyisatechniqueofliquidchromatographywhichseparatesbiomoleculesthroughbiospecificinteractions.基本原理分离过程特点应用第64页,共110页，2024年2月25日，星期天一、原理生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。第65页,共110页，2024年2月25日，星期天酶：基质类似物，抑制剂，辅酶抗体：抗原，病毒，细胞细胞：细胞表面特异蛋白，外源凝集素核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，结合蛋白激素或药物：受体，载体蛋白外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞具有专一性亲和力的生物分子对第66页,共110页，2024年2月25日，星期天DefinitionsinAffinityChromatographyMatrix(基质或载体):aninertgeltowhichaligandcanbecoupledLigand(配基):acomponentwhichinteractsspecificallywiththetargetCoupling(偶联):covalentattachmentoftheligandtothematrixBinding(结合):associationbetweentheligandandthetargetMatrixSpecificligand第67页,共110页，2024年2月25日，星期天第68页,共110页，2024年2月25日，星期天（一）载体的选择1、载体要求：（1）不溶性（2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液体流动性（3）化学和机械性能稳定（4）具备大量能被活化的基因（5）抗微生物和酶的侵蚀第69页,共110页，2024年2月25日，星期天2、常用载体（1）纤维素特点：价廉、来源充足纤维性、非均一性限制大分子的掺入非专一性吸附严重用于抗体和酶的纯化（2）葡聚糖凝胶特点：化学及物理性质稳定多孔性比琼脂糖低第70页,共110页，2024年2月25日，星期天

（3）琼脂糖凝胶浓度商品2％Sepharose2B4%Sepharose4B6%Sepharose6B

凝胶浓度越低结构越疏松即多孔性越高机械强度越低第71页,共110页，2024年2月25日，星期天（4）聚丙烯酰胺凝胶（5）多孔玻璃特点：不受微生物的侵蚀耐酸、碱、有机溶剂表面非专一性吸附特点：物理化学性质稳定抗微生物侵蚀能力比琼脂糖强可供化学反应的酰胺基较多第72页,共110页，2024年2月25日，星期天（二）配基的选择1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力2、必须具备能被修饰的功能基团3、配基偶联的位置，需不影响与大分子连接的部位。4、亲和柱制备首选大分子配基。第73页,共110页，2024年2月25日，星期天以酶和底物为例：E+LELKL=[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]E0、L0：起始浓度当L0》E0时KL=[E0-EL][L0]/[EL][EL]=[E0-EL][L0]/KLKd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/KLKLKL：解离常数E：酶L：底物EL：复合物第74页,共110页，2024年2月25日，星期天（三）固相化——将配体以共价键连接于固相基质上制成固相化吸附剂载体的排斥效应小孔经凝胶会明显阻止大分子物与配基结合载体的空间障碍载体影响了配基的空间，特别是小分子配基。需加碳氢链“手臂”，长度需适中。第75页,共110页，2024年2月25日，星期天二、亲和层析的过程1、装柱和平衡2、上样、亲和吸附3、洗脱无效洗脱吸附效率不高有效吸附第76页,共110页，2024年2月25日，星期天影响吸附的因素

1、缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响。

2、流速尽可能慢，<10ml/cm2/小时3、上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml.

4、上样体积取决于亲和力，低则上样量减少，一般柱床体积的5％。

第77页,共110页，2024年2月25日，星期天

（1）非特异性洗脱法：需改变缓冲液的pH，离子浓度，介电常数和温度。a．分段洗脱法：在惰性蛋白质流出后，更换缓冲液，包括组成，pH、离子浓度或温度的改变

b．梯度洗脱法：连续改变缓冲液浓度，使洗脱能力逐渐加强（2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。洗脱方法第78页,共110页，2024年2月25日，星期天

（3）专一洗脱技术

a.竞争性效应：用与固定配基相同的游离配基进行洗脱。b.阴性洗脱：在双底物或多底物存在的亲和系统中，如果撤掉其中某一底物，使被吸附的大分子解吸附。例：在前导底物100uMNADH存在下，乳酸脱氢酶强烈吸留在固定的丙酮酸类似物上，在洗脱液中不含NADH时，脱氢酶被迅速洗脱。第79页,共110页，2024年2月25日，星期天

已使用过的柱，经过再生，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用。再生步骤：起始缓冲液重复平衡一次用高离子强度和低离子强度溶液处理用弱酸或弱碱溶液处理4、亲和柱的再生：第80页,共110页，2024年2月25日，星期天三、特点1、只需一步纯化步骤，非常简单2、产物非常纯＞95%第81页,共110页，2024年2月25日，星期天三、特点3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质4、还可去除已变性或部分降解物质5、但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制6、载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化第82页,共110页，2024年2月25日，星期天四、应用1、分离和纯化2、分辨化学或遗传学上修饰的酶3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结构研究4、纯化人工合成的多肽和蛋白质5、解释酶作用机理第83页,共110页，2024年2月25日，星期天IV.Hydrophobicinteractionchromatography（HIC）疏水层析第84页,共110页，2024年2月25日，星期天基本原理操作介质的选择配基的选择疏水层析的影响因素疏水层析的优点疏水层析第85页,共110页，2024年2月25日，星期天

疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobicinteractionchromatography，HIC)，它也属于吸附层析一类,通过表面疏水性的差异来分离蛋白质的柱层析方法。一、疏水层析的原理第86页,共110页，2024年2月25日，星期天

不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱顺序为Tyr、Ile、Phe、Pro、Val、Leu、Met、Ala。第87页,共110页，2024年2月25日，星期天第88页,共110页，2024年2月25日，星期天（一）疏水作用蛋白质与固定相结合原理蛋白质表面存在的疏水补丁蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分子内部的疏水残基暴露至分子表面疏水层析的特性：即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水残基容易与疏水性固定相结合洗脱原理

通过降低流动相的离子强度，将结合于固定相的物质按结合能力的大小依次洗脱下来（疏水作用弱的物质先被洗脱下来，随着离子强度的进一步降低，结合能力强的物质也被逐渐洗脱）第89页,共110页，2024年2月25日，星期天（二）吸附剂根据基质的性质不同分为：1.亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖（Sepharose）,配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统2.非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等，配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，特别适用于高压层析（如HPLC等）第90页,共110页，2024年2月25日，星期天二、操作1.制备层析柱2.加样与洗脱3.层析柱再生第91页,共110页，2024年2月25日，星期天Equilibration1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionEquilibratethecolumnandadjustthesampletobindingconditionsHydrophobicligandGelmatrixWatermolecules第92页,共110页，2024年2月25日，星期天Sampleapplication1.Equilibration2.Sampleapplication3.

Washing4.ElutionGelmatrixProteinsHydrophobicgroups第93页,共110页，2024年2月25日，星期天Washingoutunboundmaterial1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-boundproteins第94页,共110页，2024年2月25日，星期天Elution1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionTargetelutesConc.saltAbs第95页,共110页，2024年2月25日，星期天ElutionConc.saltAbs1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionMorestronglyboundproteins第96页,共110页，2024年2月25日，星期天样品的准备：往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓度达到与平衡液基本一致，并调节样品溶液的pH使其满足吸附条件。HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样第97页,共110页，2024年2月25日，星期天洗脱的方式：

采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；通过往流动相中添加有机溶剂，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱（溶剂中稳定性良好的物质）往流动相中添加去污剂等，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）第98页,共110页，2024年2月25日，星期天洗脱理论：疏溶剂理论：1976年由Sinanoglu等人提出，认为由于溶质分子有减少其与水接触的非极性表面的倾向，而增加了与疏水配基结合的概率。自由能分离理论：1979年Vanoss等人提出，认为生物体界面自由能比水低，与配基产生范德华力，这个引力随溶液盐析能力的改变而改变。熵分离理论：1984年Regnier提出，认为高盐溶液中，蛋白质疏水区域的邻近分子是有序排列，疏水部分易于配基结合，减弱了水分子排列的有序度，表面水分子被排斥开，使体系熵增加。第99页,共110页，2024年2月25日，星期天三、介质的选择主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质；

近年来研制超大琼脂糖(superporous)，在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好的分辨率；壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来在疏水层析中也得到了应用。

第100页,共110页，2024年2月25日，星期天介质的再生、贮存再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微生物钝化失活起到消毒的效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的清洗剂。贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防