医学微生物学实验课件

细菌的分布与外界因素对细菌的影响

病原生物学实验实验一第一部分医学微生物学实验课的要求四、认真分析实验结果，探讨实验原理，得出可能的结论。若实验结果与理论不符合时，要加以分析讨论，以逐步提高自己的科学思维能力。认真分析五、实验课后，须按时按要求递交实验报告。提交报告六、防止发生各种事故。防止事故一、严格遵守实验室规则，严格执行无菌操作。无菌操作二、实验前做好预习，做到心中有数。课前预习三、示教的实验要仔细观察，联系有关理论积极思考。仔细观察医学微生物学实验课的要求01第二部分医学微生物学实验室规则医学微生物学实验室规则02一进入实验室必须穿实验服，必要的文具应放在抽屉里，个人物品如书包、衣物等一律不得带入实验室。用过的滴管、玻片等带菌器材，应放在指定的地方，不得将带菌液体倾入水槽。若发生割破手指、菌液进入眼等事故时，应立即报告老师，及时进行预防处理。二三四爱护公物，节约使用实验材料。医学微生物学实验室规则02五离开实验室前，用消毒液将手浸泡5～10分钟，并用自来水冲洗干净后，方可离室。值日生负责整理清洁实验室，关好水、电、门、窗。未经许可，不得将实验室内任何物品（特别是菌种）带出室外。六七八实验完毕，应清理桌面，把用过的物品放回原处（如显微镜、接种环、染色液等），需培养物品按要求放温箱。第三部分实验报告书写0102030506040708实验题目实验目的实验原理实验结果实验方法实验报告书写03实验材料结果分析实验意义第四部分实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响能了解水和空气中细菌的分布；能说出存在皮肤、咽喉的主要菌种；能举出常用的皮肤化学消毒剂种类以及阐述出这些消毒剂的作用浓度和作用原理；能熟练、规范、正确地进行皮肤消毒操作。能够理解高压蒸汽灭菌法、紫外线灭菌法及药物敏感实验的原理；能熟练、规范、正确地进行高压蒸汽灭菌、紫外线灭菌法及药物敏感实验；能正确判断解释药物敏感实验的结果判断及解释临床意义实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响教学目标实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响实验内容１.空气中细菌的检查２.水中细菌的检查３.皮肤消毒试验４.飞沫中细菌的检查１.高压蒸汽灭菌法２.紫外线杀菌试验３.药物敏感试验细菌的分布检查一二外界因素对细菌的影响实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响细菌的分布检查一、细菌的分布检查目的：了解微生物在自然界及正常人体的分布，对于在医疗实践及科学实验中树立无菌观念有着重要的意义。

材料：普通琼脂平板血琼脂平板

MH琼脂平板３７℃温箱无菌棉签等普通琼脂平板血琼脂平板实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响（一）空气中细菌的检查（示教）细菌的分布检查未被过滤空气中的细菌菌落过滤后空气中的细菌菌落实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响（二）水中细菌的检查（示教）细菌的分布检查取水样1ml注入无菌空平皿内融化并冷却至约45℃的培养基将15ml培养基加入平皿倒置于37℃温箱培养18-24小时观察结果实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响（三）皮肤细菌的检查1.分区标记

2.接种

3.培养细菌的分布检查空白对照消毒后消毒前常用的皮肤消毒剂实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响（四）飞沫中细菌的检查用咳碟法将咽喉部细菌接种于血平板细菌的分布检查实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响二、外界因素对细菌的影响当外界环境条件发生巨大改变，可导致微生物的主要代谢活动发生障碍，生长停顿，甚至死亡。外界因素对细菌的影响实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响（一）高压蒸汽灭菌法（示教）1.原理：利用密闭的金属锅，密闭加热使锅内蒸汽压力增大，温度随之升高，杀菌力增强。外界因素对细菌的影响手提式高压蒸汽灭菌器实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响高压蒸汽灭菌器构造：外界因素对细菌的影响高压蒸汽灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上方或前方有金属厚盖。盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸汽不能外溢，因而蒸汽压力升高，其温度亦相应的增高。实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响2.高压蒸汽灭菌器使用方法外界因素对细菌的影响（1）

加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。（2）

盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。（3）

加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气，关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(103.4kPa,121.3℃)，保持压力和温度维持15～30min。（4）

待压力自行降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。切不可在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免瓶内液体等冲出外溢。

实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响3.高压蒸汽灭菌器用途外界因素对细菌的影响凡耐高温和潮湿的物品，如培养基、生理盐水、衣服、纱布、棉花、敷料、玻璃器材、传染性污物等都可应用本法灭菌。实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响（二）紫外线杀菌试验外界因素对细菌的影响1.原理：通过紫外线的照射，破坏及改变微生物的DNA结构，使细菌当即死亡或不能繁殖后代，达到杀菌的目的。紫外线杀菌特点优点

简单便捷、广谱高效、无二次污染、便于治理和实现自动化等优点。缺点穿透能力弱实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响2.材料外界因素对细菌的影响普通琼脂平板18-24h细菌培养物紫外线灯等实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响2.方法外界因素对细菌的影响普通琼脂平板18-24h细菌培养物紫外线灯等细菌接种于普通琼脂平板上打开皿盖，放置于紫外灯下约30cm处，用盖子盖住半边做对照，照射半小时后盖好盖子。培养实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响（三）药物敏感实验外界因素对细菌的影响目前临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法、稀释法、抗生素浓度法、自动化仪器等实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响（三）药物敏感实验——标准纸片扩散法（Ｋ－Ｂ）外界因素对细菌的影响1.原理：将含有定量抗生素的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗生素的浓度呈对数减少,在药物浓度到达的范围内对此药敏感的细菌不能生长而形成透明的抑菌圈，不同细菌形成的抑菌圈各不相同，抑菌圈的大小反映了测试菌对该药的敏感程度，并与该药物对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关。实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响（三）药物敏感实验——标准纸片扩散法（Ｋ－Ｂ）外界因素对细菌的影响2.材料菌种：葡萄球菌、大肠杆菌菌液培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）试剂：各种抗菌药物纸片（PEN、GEN、STR、CHL)实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响3.方法外界因素对细菌的影响用灭菌棉试蘸取试验菌涂抹在MH培养基表面，要均匀涂抹3次，室温下待干燥以无菌镊子(烧灼灭菌，注意镊子要冷却）取各抗生素纸片贴于表面培养各纸片中心距>24mm,纸片距平板边缘应>15mmPENGENSTRCHL实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响4.结果判断外界因素对细菌的影响用毫米尺量取抑菌圈直径，参考实验指导表3-6的标准判读结果，按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报告。

实验一细菌的分布与外界因素对细菌的影响纸片法药敏实验结果解释外界因素对细菌的影响抗菌药物耐药（mm）中介（mm）敏感（mm）青霉素≤28－≥29庆大霉素≤1213-14≥15链霉素≤1112-14≥15氯霉素≤1213-17≥18一、光学显微镜油镜的使用和保护法一、光学显微镜油镜的使用和保护法显微镜的构造显微镜的构造图显微镜的使用方法油镜头的辨认显微镜的维护一、光学显微镜油镜的使用和保护法油镜加香柏油的原理玻璃折射率：

n=1.52香柏油折射率：

n=1.515二、细菌标本染色检查法二、细菌标本染色检查法

细菌个体微小，无色半透明，染色后能在显微镜下识别其各种不同结构，并鉴别细菌。二、细菌标本染色检查法二、细菌标本染色检查法革兰染色法（一）革兰染色法

丹麦细菌学家Gram于1884年发明的一种鉴别细菌的染色法。可将细菌鉴别为革兰氏阳性G+菌和革兰氏阴性G-菌两大类。二、细菌标本染色检查法革兰染色法原理1.原理（1）通透性学说革兰氏阳性菌细胞膜的通透性比阴性菌低，进入细胞的染料和碘液结合生成沉淀，脱色剂较易通过革兰氏阴性菌的细胞膜，将碘和染料的复合物溶解洗出，故易脱色；阳性菌细胞膜透通性低，故不易脱色。二、细菌标本染色检查法革兰染色法原理1.原理（2）等电点学说

革兰阳性菌等电点（PI2~3）比革兰阴性菌的等电点（PI4~5）低。在同一PH条件下，阳性菌比阴性菌所带负电荷要多，与带正电荷的碱性染料结合力较牢固，不易脱色。二、细菌标本染色检查法革兰染色法原理1.原理（3）化学学说

革兰氏阳性菌细胞内含有某种特殊化学成份，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它能和料染一煤染剂复合物相互结合，使已着色的细菌不易脱色。二、细菌标本染色检查法革兰染色法实验材料2.实验材料（1）菌种培养18~24h的葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌。（2）试剂生理盐水、革兰氏染色液。（3）仪器及用具接种环、酒精灯、玻片、显微镜、香柏油等。二、细菌标本染色检查法实验方法3.实验方法（1）细菌涂片标本的制作制备涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定二、细菌标本染色检查法细菌涂片标本的制作3.实验方法1）涂片①接种环置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌。二、细菌标本染色检查法细菌涂片标本的制作3.实验方法1）涂片②取1～2环生理盐水（NS)置于载玻片上，接种环用火焰烧灼灭菌。二、细菌标本染色检查法细菌涂片标本的制作3.实验方法1）涂片③小指和手掌小鱼肌侧拔掉棉塞，并烧灼试管口灭菌。用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取适量菌，注意勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。二、细菌标本染色检查法细菌涂片标本的制作3.实验方法1）涂片④再次灭菌试管口，棉塞略加烧灼放回原处。

⑤将接种环上之菌涂于载玻片的NS上，制成的菌膜直径约1cm左右均匀薄层。⑥接种环用火焰烧灼灭菌放回原处。注：取菌量不应过多，以免造成菌体重叠。二、细菌标本染色检查法细菌涂片标本的制作3.实验方法２）干燥①室温中自然干燥。②加速干燥，将标本离火焰半尺高处略烘。注：不宜离火焰过近，以免造成菌体过热变形。二、细菌标本染色检查法革兰染色法3.实验方法（２）革兰染色法二、细菌标本染色检查法革兰染色法操作步骤3.实验方法结晶紫、初染，60秒碘液媒染60秒丙酮酒精数滴，脱色约60秒碱性复红液2～3滴，30秒钟待干，镜检。注：每一步均需细流水冲洗。二、细菌标本染色检查法革兰染色法结果观察４.结果观察油镜观察结果（1000×）放大倍数：10×100二、细菌标本染色检查法革兰染色法结果观察４.结果观察白色念珠菌革兰染色（1000×）放大倍数：10×100二、细菌标本染色检查法革兰染色法意义５.革兰氏染色意义（1）鉴别细菌（2）选择抗菌药物（3）研究细菌致病性

G+菌能产生外毒素，G-菌能产生内毒素，两者的致病作用不同。二、细菌标本染色检查法革兰染色法注意事项６.注意事项（1）脱色过度，可使G+菌被误染为G-菌；（2）脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，以涂片薄而均匀为好；（3）多种因素如菌龄、染色时间、pH等影响结果。二、细菌标本染色检查法抗酸染色法（二）抗酸染色法１.原理：

分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，特别是其中大量分枝菌酸可影响染料穿入。一旦着色后不易被盐酸酒精脱色。二、细菌标本染色检查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.材料:（1）结核病人的痰液标本（2）抗酸染色液试剂盒（3）试管夹、玻片等。二、细菌标本染色检查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.方法

（1）涂片制备挑取痰液在玻片上涂成痰膜干燥固定二、细菌标本染色检查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.方法(２）染色方法初染：石炭酸复红染液(加染料然后加热至蒸汽冒出后放至一边继续染色至5min)，水洗。脱色：盐酸酒精脱至无色，水洗。复染：碱性美兰（1min)，水洗。二、细菌标本染色检查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.结果观察:抗酸阳性菌为红色抗酸阴性菌为蓝色二、细菌标本染色检查法抗酸染色法（二）抗酸染色法２.结果结果报告方式（直接涂片法）仔细观察300视野(观察时间不少于4min)，未发现抗酸杆菌。

士：可疑。发现抗酸菌l～2条／300视野。

+：发现抗酸菌3～9条／100视野。

++：发现抗酸菌1～9条／10视野。

+++：发现抗酸菌1～9条／每视野。

++++：发现抗酸菌≥10条／每视野。二、细菌标本染色检查法墨汁负染色法（二）墨汁负染色法1.原理

新型隐球菌的荚膜较厚，一般不易着色，同时菌体折光性较强，用墨汁负染色法可在黑色背景下看到透亮的菌体。二、细菌标本染色检查法墨汁负染色法（二）墨汁负染色法2.材料（1）菌种新型隐球菌（2）试剂优质墨汁（3）其他载玻片、盖玻片、镊子二、细菌标本染色检查法墨汁负染色法（二）墨汁负染色法2.材料（1）菌种新型隐球菌（2）试剂优质墨汁（3）其他载玻片、盖玻片、镊子二、细菌标本染色检查法墨汁负染色法（二）墨汁负染色法3.方法（1）滴一滴墨汁于载玻片,取菌并混匀。（2）盖盖玻片（覆盖于菌液上，注意先将盖玻片一边接触菌液缓缓斜放下，以免产生气泡）。（3）先低倍镜找好视野，再换高倍镜／油镜观察。二、细菌标本染色检查法墨汁负染色法（二）墨汁负染色法4.结果观察二、细菌标本染色检查法墨汁负染色法（二）墨汁负染色法4.临床意义新型隐球菌可引起全身各组织器官炎症，最易侵犯的是中枢神经系统，引起慢性脑膜炎。墨汁负染色法可鉴别新型隐球菌。三、细菌特殊结构的观察三、细菌特殊结构的观察细菌特殊染色法：鞭毛染色法芽胞染色法四、实验报告书写0102030506040708实验题目实验目的实验原理实验结果实验方法实验报告书写03实验材料结果分析实验意义四、实验报告要求实验报告要求（一）实验报告内容要求1.绘图葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌的基本示意图，记录革兰氏染色结果，分辨出革兰阳性菌和革兰阴性菌。2.

如果染色结果不理想，请分析原因。四、实验报告要求实验报告要求（二）细菌形态示意图绘图要求1.选择形态典型的部分细菌，红兰色笔绘图。2.绘细菌的形态、排列，细菌的大小比例应适宜，轮廓上（如球菌、杆菌）应有所区分。注明菌名：大肠杆菌染色法：放大倍数：10×100一、细菌的人工培养一、细菌的人工培养基本知识（一）细菌人工培养的基本知识1.细菌人工培养的目的感染性疾病的病原学诊断

鉴定细菌，指导临床用药。细菌学研究

用于细菌生理、遗传变异、致病性和耐药性等研究。生物制品的制备

疫苗、抗毒素等的制备。一、细菌的人工培养基本知识（一）细菌人工培养的基本知识2.细菌人工培养的基本步骤制备培养基接种培养一、细菌的人工培养基本知识（一）细菌人工培养的基本知识3.细菌培养基的种类根据营养组成和用途可分为基础、增菌、选择、鉴别、厌氧根据物理状态分为液体、固体、半固体鉴别培养基一、细菌的人工培养基本知识（一）细菌人工培养的基本知识3.细菌培养基的种类普通平板血平板半固体培养基液体培养基一、细菌的人工培养基本知识（一）细菌人工培养的基本知识4.培养基的制备调配成分溶解矫正pH过滤澄清分装灭菌质量检查和保存一、细菌的人工培养基本知识（一）细菌人工培养的基本知识5.细菌培养方法需氧培养法二氧化碳培养法厌氧培养法一、细菌的人工培养基本知识（一）细菌人工培养的基本知识5.细菌培养方法需氧培养法二氧化碳培养法厌氧培养法二氧化碳培养箱电热恒温培养箱一、细菌的人工培养基本知识（一）细菌人工培养的基本知识5.细菌培养方法烛缸二氧化碳培养法厌氧袋一、细菌的人工培养操作内容（二）细菌人工培养操作1.操作内容操作内容目的平板分区划线分离细菌斜面纯培养增菌及菌种保存半固体培养观察动力和菌种保存一、细菌的人工培养实验材料（二）细菌人工培养操作2.材料工具：接种环、接种针菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌培养基：普通平板培养基、斜面培养基、半固体培养基一、细菌的人工培养实验材料（二）细菌人工培养操作2.材料斜面培养基(2-3%琼脂)半固体培养基(0.2-0.5%琼脂)普通平板培养基(2-3%琼脂)一、细菌的人工培养操作流程（二）细菌人工培养操作3.操作流程领取菌种及培养基分别进行平板、斜面及半固体培养基接种，然后贴上标签。37度恒温箱培养18～24小时后观察结果。一、细菌的人工培养实验方法及结果（二）细菌人工培养操作4.实验方法及结果平板分区划线法分区划线结果一、细菌的人工培养实验方法及结果（二）细菌人工培养操作4.实验方法及结果斜面纯培养一、细菌的人工培养实验方法及结果（二）细菌人工培养操作4.实验方法及结果半固体培养结果穿刺接种二、细菌的生化反应二、细菌的生化反应（一）生化反应基本原理基本原理不同的细菌含有不同的分解代谢的酶具有不同的分解代谢途径对同一营养物质的分解代谢及其产物有所不同知识点

利用生化方法检测代谢产物以判断细菌的分解代谢特征，从而达到鉴定细菌的目的。称：细菌的生化反应检测法二、细菌的生化反应常见的生化反应基本原理对糖的发酵甲基红试验单糖发酵试验VP试验对蛋白质的分解吲哚试验硫化氢试验枸橼酸盐利用试验尿素酶试验其他试验二、细菌的生化反应（二）实验材料实验材料1.菌种大肠埃希菌、沙门氏菌2.微量生化反应管葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、蛋白胨水（靛基质）、硫化氢。3.试剂吲哚试剂二、细菌的生化反应（三）实验操作内容糖发酵试验糖发酵试验（1）原理大肠埃希菌：分解乳糖产酸产气致病性肠道细菌：大多数不分解乳糖CO2↑+H2↑糖\醇类细菌产生的酶酸（HCOOH)脱氢酶（培养基含葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇或蔗糖等一种糖类，并加酸碱指示剂，如溴甲酚紫）二、细菌的生化反应（三）实验操作内容糖发酵试验糖发酵试验（2）方法大肠埃希菌、沙门氏菌37℃培养18～24h接种针穿刺接种5种糖生化反应管观察结果二、细菌的生化反应（三）实验操作内容糖发酵试验糖发酵试验（3）结果判断——观察培养基颜色变化与气体产生情况溴甲酚紫紫色黄色中性或碱性酸性对照+-+有细菌生长培养基呈混浊，可能出现3种结果。二、细菌的生化反应（三）实验操作内容靛基质（吲哚）试验2.靛基质（吲哚）试验（1）原理玫瑰吲哚（红色）色氨酸色氨酸酶吲哚（无色）吲哚试剂培养基中加入色氨酸二、细菌的生化反应（三）实验操作内容靛基质（吲哚）试验2.靛基质（吲哚）试验（2）结果判断——观察培养基与吲哚试剂交界处颜色变化阳性阴性(+）

（-)二、细菌的生化反应（三）实验操作内容

硫化氢试验3.硫化氢试验（1）原理硫化铁或硫化铅（黑褐色）含硫氨基酸酶硫化氢（无色）+铁离子或+铅离子培养基中加入含硫氨基酸、铅离子、铁离子二、细菌的生化反应（三）实验操作内容

硫化氢试验3.硫化氢试验（2）结果判断分组与材料分配分组与材料分配分组两人一组操作内容细菌的人工培养细菌的生化反应菌种金葡菌、大肠杆菌各一支沙门氏菌、大肠杆菌各一支培养基1块普通平板/人7种生化反应管/人1支斜面培养基/人1支半固体培养基/人一、病例的分析方法一、病例的分析方法病例分析病例主诉：持续发热、腹泻3天。病史：一周前外出旅游，回来后食欲不振，开始发热，第一次量体温是38℃，而后多次量体温都是39.5℃。发热的同时有腹涨、腹泻，大便刚开始成形，后成水样，一天四到五次。曾服用氟哌酸，无效。查体：患者表情淡漠，体温39℃，脉搏50次/分，腹部触疹肝脾肿大，其他无异常。二、肠杆菌科细菌鉴定程序二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序（二）肠杆菌科细菌鉴定程序血液标本粪便标本分离培养SS/EMB生化试验血清学试验药敏试验增菌培养纯培养KIA二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序（一）肠杆菌科细菌分离鉴定常用培养基分离培养——选择性培养基SS:分解乳糖——菌落呈粉红色不分解乳糖——菌落呈无色半透明SSEMB二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴别培养基伤寒沙门菌SS大肠杆菌SSSS:分解乳糖——菌落呈粉红色不分解乳糖——菌落呈无色半透明福氏志贺菌SS二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴别培养基EMB:分解乳糖——菌落呈深紫色并有金属光泽不分解乳糖——菌落呈无色或淡黄色半透明大肠杆菌EMB平板二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序（一）肠杆菌科细菌分离鉴定常用培养基2.纯培养——KIA培养基下层观察颜色、产气：变黄——分解葡萄糖产酸变黄且培养基断裂——产酸产气2.观察黑色沉淀——产生硫化氢上层观察颜色：变黄——分解乳糖产酸变红——不分解乳糖二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序KIA培养基结果可作出初步鉴定葡萄糖乳糖硫化氢大肠埃希菌＋＋－沙门菌属＋－＋志贺菌属＋－－二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序阴性对照铜绿假单胞菌宋内志贺菌伤寒沙门菌大肠杆菌变形杆菌二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序3.肠杆菌科细菌生化编码鉴定管二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序生化编码鉴定管基本原理氨基酸脱羧酶试验赖氨酸鸟氨酸氨基酸脱羧酶培养基pH↑尸胺腐胺+CO2

为防止出现假阳性结果，必须同时接种氨基酸对照管，并且接种后在氨基酸管内滴加液体石蜡。结果：指示剂为溴甲酚紫，碱性呈紫色为阳性酸性呈黄色为阴性注意：对照管应为阴性，否则实验失败二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序生化编码鉴定管基本原理②苯丙氨酸脱氨试验苯丙氨酸苯丙氨酸脱氨酶深绿色反应苯丙酮酸结果：绿色——阳性不变色——阴性+FeCl3二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序生化编码鉴定管基本原理③脲酶试验（尿素分解试验）尿素尿素酶碳酸铵培养基pH↑结果：指示剂为酚红粉红色——阳性不变色——阴性阳性阴性对照2NH3+CO2+H2O2NH4OH+CO2二、肠杆菌科细菌鉴定程序鉴定程序生化编码鉴定管基本原理④枸橼酸盐利用试验

——培养基中只有枸橼酸盐一种碳源，细菌能利用枸橼酸盐则可以生长，并分解氨基酸。枸橼酸盐氮源（氨基酸）培养基pH↑溴麝香草酚蓝指示剂变蓝色结果：蓝色——阳性不变色——阴性对照+-三、细菌的血清学试验三、细菌的血清学试验血清学试验鉴定菌种血清学鉴定血清学诊断诊断疾病玻片凝集反应试管凝集反应三、细菌的血清学试验血清学试验原理（一）实验原理根据抗原抗体反应具有高度特异性的特点，用已知抗体来检测未知抗原（细菌）；或用已知的抗原（细菌抗原）来检测血清中未知抗体的效价（肥达反应），从而辅助诊断疾病。三、细菌的血清学试验血清学试验原理细菌的血清学试验——沙门氏菌为例沙门氏菌的主要抗原组成O抗原：至少58种,含相同抗原组分归为一组，引起人类疾病的沙门菌大多数在A~F组。H抗原：分为Ⅰ、Ⅱ相，Ⅰ相以a、b、c等表示，Ⅱ相以1、2、3等表示。Vi抗原：抗原性弱，不稳定，可阻止O抗原与其相应抗体的凝集反应。三、细菌的血清学试验血清学试验原理1.血清学诊断——肥达反应5050505050505050501:401:801:1601:3201:64050弃掉1234550650NS(μl

)待测血清对照管①②③④灭活的伤寒菌液（已知抗原）50μl

50μl

50μl

50μl

50μl

50μl

待测血清稀释度彻底混匀52℃,1h100100100100100三、细菌的血清学试验血清学试验原理细菌的血清学试验——肥达反应结果判断与分析（1）

观察凝集程度上清沉淀凝集程度清亮大的凝集块++++轻度混浊大多凝集管底+++中等混浊小、部分凝集块++混浊很小的凝集颗粒+与对照相同无凝集现象-三、细菌的血清学试验血清学试验原理细菌的血清学试验——肥达反应结果判断与分析（2）判定效价（滴度）：产生明显凝集反应（++）的最高血清稀释度为血清中所测抗体的效价。效价愈高，表示血清中所含该抗体愈多。如血清的最低稀释度仍无凝集，或血清效价低于1：80，则为阴性，应报“<1：80”；如果血清的最高稀释度1：1280仍呈“++”或更强凝集，则血清效价应报“>1：1280”。三、细菌的血清学试验血清学试验原理细菌的血清学试验——肥达反应结果判断与分析（3）

人体血清中H与O抗体的性质及其消长意义抗体类型体内出现特征体内出现情况O抗体IgM出现较早，维持时间短高高低H抗体IgG出现较晚，维持时间长高低高患肠热症可能性大感染早期、其他沙门菌引起的交叉反应预防接种；非特异性回忆反应三、细菌的血清学试验血清学试验原理思考题1.李某发热、全身不适，体温持续升高，最高达40℃，采血进行肥达氏实验检测，检测结果是O抗体凝集效价是1:80，H抗体凝集效价是1:320。请根据肥达氏试验检测结果分析李某的感染情况。三、细菌的血清学试验血清学试验原理沙门氏菌属国内常见菌型诊断抗原表群别菌型抗原OHA甲型副伤寒沙门菌1,2,12a:-B乙型副伤寒沙门菌德比沙门菌鼠伤寒沙门菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C

猪霍乱（或丙型副伤寒）沙门菌6,7,(Vi)c:1,5D伤寒沙门氏菌9,12,Vid:-E鸭沙门氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙门氏菌11i:1,22.细菌的血清学鉴定——玻片凝集反应三、细菌的血清学试验血清学试验原理沙门氏菌诊断血清（11种已知抗体）O2O4O7O9HaHbHcHdHiViA-F群多价OA-F群多价O三、细菌的血清学试验血清学试验（4）结果分析群别菌型抗原oHA甲型副伤寒沙门菌1,2,12a:-B乙型副伤寒沙门菌德比沙门菌鼠伤寒沙门菌1,4,5,121,4,121,4,5,12b:1,2f,g:-i:1,2C猪霍乱（或丙型副伤寒）沙门菌6,7,(Vi)c:1,5D伤寒沙门氏菌9,12,Vid:-E鸭沙门氏菌3,10e,h:1,6F阿伯丁沙门氏菌11i:1,2四、实验操作内容四、实验操作内容肠杆菌科细菌鉴定（一）肠杆菌科细菌鉴定1.材料菌种1号菌、2号菌培养基SS平板、EMB平板、KIA培养基、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管试剂液体石蜡、吲哚试剂、FeCl3四、实验操作内容肠杆菌科细菌鉴定2.分组与材料分配（1）2人/组（2）1种待检菌/人（3）SS、EMB各1个/人（4）1支KIA/人（5）生化编码管1套/人四、实验操作内容肠杆菌科细菌鉴定3.方法（1）将待检细菌分别接种相应培养基平板分区划线KIA先穿刺接种底层再在斜面划线接种

微量管直接穿刺接种（2）7℃培养18~24小时（3）观察结果四、实验操作内容肠杆菌科细菌鉴定4.微量管使用方法（1）按顺序排列（2）标签、液面在胶布外（3）在所有微量管中接种细菌四、实验操作内容肠杆菌科细菌鉴定糖、醇+黄色硫化氢+黑色-紫色-不变色黄色，气泡吲哚+粉红色赖氨酸鸟氨酸+紫色-不变色-黄色枸橼酸盐+蓝色苯丙氨酸+绿色-浅绿色-不变色尿素酶+粉红色-不变色+各项生化编码鉴定管结果判断四、实验操作内容肠杆菌科细菌鉴定5.结果判断记录各项试验结果填入肠杆菌科11E编码鉴定结果记录表计算总值查询肠杆菌科11E编码鉴定手册得出菌种名称。如果有必要应做补充试验。四、实验操作内容肠杆菌科细菌鉴定肠杆菌科生化编码鉴定管结果记录方法AG++++-----470AG470大肠埃希菌+四、实验操作内容肠杆菌科细菌鉴定肠杆菌科生化编码鉴定管结果记录方法A+-++-++--730沙门菌属A730+四、实验操作内容血清学试验（二）血清学试验——血清学鉴定血清学鉴定材料分配分组4人/组菌种待测菌种一支诊断血清1盒/组四、实验操作内容血清学试验血清学鉴定流程A-F群多价及ViA-F群多价-Vi-非沙门氏菌，无需继续鉴定A-F群多价+Vi-初步判断为沙门氏菌属继续鉴定O抗原、H抗原成分。A-F群多价-Vi+初步判断为沙门氏菌属去除菌体Vi荚膜继续鉴定其他抗原成分。病例分析的书写要求病因，病史、主要病症体格检查辅助检查分析结论病例1王某某，女，51岁，农民主诉：右手指割伤5天，发热、头疼2天病史：患者于5天前手指被镰刀割伤，除稍加包扎外未作任何处置。包扎伤口因洗菜等多次被水弄湿，次日手指肿痛，开始服用去痛片及磺胺等，近两天自觉发热、头疼、全身不适而求医。体检：右手食指伤口红肿，有少许粘稠黄白色分泌物，右液窝淋巴结可触及，余均正常。体温37.8℃，白细胞总数12000/mm3，中性粒细胞80%。病例分析中年女性2.右手指割伤5天，手指肿痛4天，发热、头疼2天。查体：T37.8℃；右手指红肿，有黄色脓液；右腋窝淋巴结肿大。辅助检查：白细胞总数12000/mm3，中性粒细胞80%。右手指割伤后化脓性炎症

需氧菌：葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌等厌氧菌：产气荚膜梭菌、无芽胞厌氧菌等创伤感染化脓菌病例2任某某，男，21岁，医学院学生主诉：持续发热5天，伴全身不适。病史：患者于2周前到校外的小食店进食凉菜，于5天前无明显诱因出现发冷发烧，全身不适，多汗，食欲不振等。体检：患者呈急性面容、潮红、神清但略有呆滞，前胸见散在的细小红色丘疹。体温39.4℃，脉缓52次/min，心、肺无阳性体症，睥可触及，白细胞3600/mm3，中性粒细胞60%。

病例分析青年男性进食凉菜后发热，伴全身不适5天。查体：体温39.4℃，脉缓52次/min；表情淡漠；前胸皮肤玫瑰疹；脾大。辅助检查：白细胞3600/mm3，中性粒细胞60%。疑似沙门菌感染所导致的肠热症

病例3

患者黄××，男，65岁，因外伤手术后持续发热，腹痛，于2007年3月31日再次会诊。患者于一周前因车祸，造成腹部外伤，肠穿孔，紧急送医院作肠吻合术，输入青霉素。患者术后体温仍高达39℃，腹部有明显压痛，危重病容。遂由内、外科医师大会诊。经化验检查，白细胞总数5000/mm3，中性粒细胞90%，淋巴细胞10%，血培养有革兰氏阴性杆菌生长。病例分析老年男性腹部外伤手术后持续发热，腹痛一周。查体：体温39℃；危重病容；腹部明显压痛。辅助检查：白细胞5000/mm3，中性粒细胞90%，淋巴细胞10%，血培养有革兰氏阴性杆菌生长。疑似肠道细菌引起的肠道外感染病例4患者：男，27岁。主诉：左下颌肿痛伴发热5天。现病史：7天前患者左下后牙出现持续性钝痛，逐渐加重，后发展为剧烈跳痛；5天前左下颌突然肿胀，疼痛更加剧烈，并向同侧耳颞部放射。经当地卫生院连续4天抗菌治疗（静脉滴注青霉素），未见好转，局部疼痛和肿胀更加明显，并有吞咽痛及开口轻度受限。患者体温升高，食欲减退，精神疲惫。既往史：左下后牙反复疼痛史1年；每次发作时，均可经抗生素治疗后好转。体检：患者急性痛苦面容，体温38.6度，左颌面部肿胀，下颌骨下缘轮廓消失，皮肤紧张，压痛，皮温增高，肤色发红，有波动感。开口度3cm。龈及前庭沟黏膜充血水肿，龈袋内有脓液。口底黏膜充血水肿，舌运动轻度受限。实验室检查：白细胞15000/mm3，中性粒细胞90％。病例分