课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段课件

专题五DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA技术课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段知识回顾DNA分子的结构C、H、O、N、P1、组成元素脱氧核苷酸2、基本单位3、脱氧核苷酸结构课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段复习DNA复制的条件解旋酶：打开DNA双链DNA母链：提供DNA复制模板4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链引物：使DNA连接脱氧核苷酸ATP课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段1、DNA分子的平面结构ATGCAGCT氢键5'端3'端5'端3'端-OH端为3′磷酸基团的末端为5′。课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段DNA的双螺旋结构是如何形成的课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段2、复制过程解读 ①DNA的解旋亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链②RNA引物的合成,以单链DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段③DNA的生成以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5’端－3’端合成DNA。④切掉引物生成冈崎片断在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段⑤DNA片断的连接在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的子代DNA课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段1、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物2、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸想一想课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段思考：

能否在体外模拟体内DNA复制条件，进行DNA扩增？PCR技术课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段1、PCR（多聚酶链式反应）技术：2、原理：一、基础知识

（一）PCR原理：阅读课本P58-59课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段DNA母链：解旋酶(条件）：4种脱氧核苷酸：DNA聚合酶（条件）：ATP：引物：缓冲溶液适宜温度3、PCR反应的条件80—100℃：耐热的DNA聚合酶：课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段(二)PCR反应的过程1、变性：

温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。2、复性（退火）：

温度下降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3、延伸：

温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR循环第一步：加热变性:双链DNA解聚成为单链课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段模板序列模板序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段模板序列模板序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸:合成新的DNA链课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段模板序列模板序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,82430次循环后扩增的数量课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段4、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ（延伸而成的DNA单链）结合，进行DNA的延伸。课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR反应详细解析第一轮变性ＡＢ复性ＡＢ课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段延伸ＡＢ第二轮Ａ变性Ａ1Ａ2A链PCR课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段复性Ａ1Ａ2延伸Ａ1Ａ2PCR终产物课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段B链PCR变性BB1B2复性B1B2课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR终产物延伸B1B2第三轮A1B2同A链第二轮PCR反应同B链第二轮PCR反应课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段试验设计利用PCR技术扩增双歧杆菌的DNA的片段课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段实验器材双歧杆菌培养基离心机微量移液器化学试剂PCR仪课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段1.双歧杆菌的培养培养24h培养基配方：大豆蛋白胨5g酵母提取物10g

微量盐溶液40ml葡萄糖10g

半膀氨酸盐酸盐0.5g0.1%胰胨5g

刃天青1mlPH=7实验过程课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段2.PCR操作菌液离心，保留底部双歧杆菌沉淀在双歧杆菌沉淀中加入0.2ml裂解液，使细胞裂解，释放DNA3.DNA处理2.提取DNA55℃加热孵育3h90℃加热10min冷冰中冷却离心1.菌体处理课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段4.其它组分添加DNA上清液10μL10倍扩增缓冲液5μL25mmol/LMgCl2溶液3μL20mmol/L4种脱氧核苷酸的均匀混合液1μLTaq聚合酶1μL两种引物各0.5μL蒸馏水29μL课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段预变性94℃，5min30次重复反应94℃，30s55℃，30s最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min72℃，1min5.PCR反应变性复性延伸课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段6.PCR产物检验分光光度计法

取2μLPCRDNA溶液，加入98μLH2O，使DNA５０倍稀释

以蒸馏水为对照，在260nm处测样品DNA的光吸收值根据公式计算DNA含量DNA含量（μg/mL）=50×（260nm度数）×稀释倍数课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段结果分析与评价根据公式计算DNA片段的含量比扩增前增加了了多少倍。课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段相关链接琼脂糖凝胶电泳法检测DNA含量1.配制浓度为１％的琼脂糖凝胶，倒入电泳槽中，插好梳子课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段2.向电泳槽中加入电泳缓冲溶液，移去梳子3.在DNA中加入载样缓冲液，混匀后，滴加到样品孔中课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段4.接通电源，电泳20-40min+-5.EB溶液染色，在紫外仪上观察电泳带及其位置，判断扩增情况课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段

观察电泳带的粗细以及分布评价扩增的效果。课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段课堂小结在体外制造与体内相同的环境，进行DNA复制反应缓冲溶液DNA模板与两条模板链结合的两种引物PCR原理PCR反应条件四种脱氧核苷酸耐热的DNA聚合酶合适的温度课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段变性复性延伸PCR反应过程课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段DNA含量检测紫外分光光度计法凝胶电泳法课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段高考链接1.2006.广东下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（）A．基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因B．基因诊断的基本原理是DNA分子杂交C．一种基因探针能检测水体中的各种病毒D．原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良B课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段解析：基因治疗是把健康的外源基因导入到有缺陷基因的细胞中；一种基因探针能检测相应的某一种特定的病毒；原核基因可以用来进行真核生物的遗传改良，例如用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因改良棉花。课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段2.2005.全国卷Ⅱ检测基因序列所必须的酶是（）

A.解旋酶

B.DNA连接酶

C.限制性内切酶

D.RNA聚合酶C课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段解析：A.解旋可以用加热法。B.DNA连接酶是在取得目的基因、并打开运载体后把它们组合起来时使用的。D.RNA聚合酶是在转录或者RNA自我复制时使用课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段3.2002.广东判断：DNA复制中单个脱氧核苷酸在DNA酶的作用下连接合成新的子链

()×解析

DNA酶包括DNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA内切酶等，此处应当指DNA聚合酶。课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段课堂练习填空题1.PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料合成新链。2.PCR经（）三个阶段为一个循环。DNA互补72℃Tap酶4种dNTP变性、复性、延伸课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段选择题1.PCR反应产物的特异性取决于()A退火温度B引物碱基组成和长度C循环次数D.A+B+CD2.PCR实验的特异性主要取决于（）A.DNA聚合酶的种类B.反应体系中模板DNA的量C.引物序列的结构和长度D.四种dNTP的浓度C课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段简答题1.PCR反应包括引物与DNA模板链间的解链与复性。讨论循环温度范围对引物-DNA双螺旋稳定性的影响及对PCR产率的影响。答：由于GC对间是三个氢键的作用力，比两个氢键作用力的AT对要稳定，因此DNA的解链与退火都是依赖于G+C的含量与A+T的含量的比例。GC对普遍比AT对更倾向于非特异性的复性，所以GC含量高的引物比AT含量高的引物更适合于PCR反应。课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段2.你打算扩增下图所示的两段序列之间的DNA，请从所列出引物中选出合适的一对，5’-GACCTGTGGAAGCCATACGGGATTG-3’3’-CTGGACACCTTCGGTATGCCCTAAC-5’引物1

引物25’-GACCTGTGGAAGC5’-CATACGGGATTG5’-CTGGACACCTTCG5’-GTATGCCCTAAC5’-CGAAGGTGTCCAG5’-GTTAGGGCATAC5’-GCTTCCACAGGTC5’-CAATCCCGTATG答：引物1：5’-GACCTGTGGAAGC

引物2：5’-CAATCCCGTATG课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段3.PCR的基本原理是什么？用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？答：（1）利用DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。（2）至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片段教学习题答案1.请绘图表示PCR反应的前三个循环步骤。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为膜拜，请计算在30次循环反应后，反应物中大约有多少个这