1.2微生物的培养技术及应用（第2课时）（课件）-高二生物学与练（人教版2019选择性必修3）

第1章

发酵工程1.2

微生物的培养技术及应用

第2课时

微生物的选择培养和计数12阐明微生物选择培养的原理进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数学习目标问题探讨

聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外扩增DNA片段的技术，此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于聚合酶链式反应（PCR）。思考：为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？这是因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。一、选择培养基

实验室筛选微生物原理：人为提供

的条件（包括_____、_____和_____等），同时

。

有利于目的菌生长抑制或阻止其他微生物的生长营养温度pH方法：利用选择培养基分离

选择培养基：在微生物学中，允许特别种类的微生物生长，同时

抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。思考·讨论：怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?一、选择培养基培养基中加氨苄青霉素具有抗氨苄青霉素能力的菌落长出各种各样的细菌基础培养基+氨苄青霉素

没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?基础培养基怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？

应设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）作为对照，若基础培养基中生长的菌落数多于该选择培养基，则说明该选择培养基具有选择性。选择培养基配方的设计尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。讨论：1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养

基的配方该如何设计？设计一种选择培养基，以尿素作为唯一氮源。(细菌生长的氮源)尿素NH3脲酶尿素分解菌尿素2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？

除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。二、微生物的选择培养1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定分解尿素的细菌的数量用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？

不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。二、微生物的选择培养

稀释涂布平板法1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL无菌水90mL无菌水10g将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。

系列稀释二、微生物的选择培养

稀释涂布平板法微量移液器

涂布平板③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表

面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。二、微生物的选择培养

稀释涂布平板法

培养待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置（同时放一个未接种的培养基），放入30~37℃的恒温培养箱中培养1~2d。恒温培养箱稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养比较平板划线法稀释涂布平板法工具接种环涂布器操作接种环在固体培养基表面连续划线系列梯度稀释操作和涂布平板操作特点方法简单，但不适宜计数单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板结果共同点常用微生物分离方法比较都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征三、微生物的数量测定②计数原则：缺点：

统计的_________往往比______的实际数目少①原理：【原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。】

方法1：稀释涂布平板法当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为_______、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出_______。活菌活菌30～300平均值3菌落数活菌间接计数法三、微生物的数量测定M：代表稀释倍数；C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)间接计数法4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为________个

方法1：稀释涂布平板法③计算公式：每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M1.1×108三、微生物的数量测定快速、直观

方法2：显微镜直接计数法直接计数法两者计数原理相同原理：利用细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数。优点：缺点：

不能区分死菌与活菌对细菌等较小的细胞进行观察和计数常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数血细胞计数板思考:为了避免上述缺点，我们该如何做？可以染色（如使用台盼蓝，死细胞会被染成蓝色）后再进行显微镜计数。三、微生物的数量测定项目显微镜直接计数法稀释涂布平板法主要用具显微镜、_____________

等培养基等计数依据菌株本身培养基上的

数优点计数方便、操作简单计数的都是活菌缺点死菌、活菌都计数在内操作复杂、有一定误差血细胞计数板或细菌计数板菌落一边阅读，一边完成学案上的表格比较稀释涂布平板法和显微镜直接计数法

细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右，取样，将样品装入事先准备好的信封中。操作步骤1.土壤取样取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。注意

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数测细菌数：一般用104、105、106稀释液。2.样品的稀释与涂布平板思考：在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证

从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？

选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分

别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300

的平板进行计数。

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数选择培养基（平行重复）牛肉膏蛋白胨培养基(作为对照)2.样品的稀释与涂布平板

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数3.培养与观察恒温培养箱待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数内容现象结论有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长实验组培养基中菌落数偏高选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目未被杂菌污染被杂菌污染选择培养基具有筛选作用问题1：你是否获得了某一稀释度下菌落数为30～300的平板？4.结果分析与评价问题2：你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数与其他同学统计的

结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数5.进一步探究得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定混合样品得到的菌落不一定就是分解尿素的细菌，如自生固氮菌或利用（分解尿素的）细菌的代谢物进行生长繁殖的微生物

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数5.进一步探究在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红酚红培养基——鉴定分解尿素的细菌脲酶CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3

探究•实践：土壤中分解尿素的细菌的分离和计数鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定目标微生物的作用。伊红-亚甲蓝琼脂培养基鉴别大肠杆菌（若有，菌落呈深紫色，有金属光泽）刚果红培养基鉴别纤维素分解菌补充资料-培养基的类型及用途）划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分用途不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、分类鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基天然培养基合成培养基鉴别培养基课堂小结微生物的