色氨酸代谢产物对肝癌细胞

关于色氨酸代谢产物对肝癌细胞立论依据

一研究意义

（1）原发性肝细胞癌（HCC）是我国常见恶性肿瘤之一，在消化道肿瘤中，其发病率仅次于胃癌。目前肝癌的治疗，除手术治疗外，化疗、放疗、生物和免疫治疗等多种治疗措施的综合运用，为提高患者生存率起到了积极的作用。但是至今，并没有找到根治肝癌的有效方法。第2页,共34页，2024年2月25日，星期天(2)自

Tayor等提出IFN-γ对肿瘤生长的抑制作用是其诱导色氨酸代谢所致的观点后，与色氨酸分解代谢有关的酶——吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）和肿瘤的关系开始倍受关注。第3页,共34页，2024年2月25日，星期天

近期的研究发现，在不同类型的肿瘤中，IDO可以扮演完全不同的角色。

第4页,共34页，2024年2月25日，星期天

在急性髓细胞样白血病、黑色素瘤等肿瘤中，IDO可以通过抑制T细胞，从而促进肿瘤的生长；而在肝癌等肿瘤中，IDO的存在可以提高机体的抗癌细胞作用,目前这一作用的具体机制尚不十分清楚。第5页,共34页，2024年2月25日，星期天（3）IDO是色氨酸分解代谢的限速酶，对色氨酸沿犬尿酸途径进行分解起到了重要作用。

IDO在多种组织中有表达，在感染、肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病以及妊娠期间，IDO的活性增强，加速色氨酸的分解。脂多糖（LPS）、IFN-γ等细胞因子能够诱导巨噬细胞、树突状细胞等表达IDO。

第6页,共34页，2024年2月25日，星期天IDO的分子式为：

NH2ONH2OHOIDO为偏脂溶性物质，可溶解于DMSO溶剂中。

第7页,共34页，2024年2月25日，星期天IDO催化反应如下：

色氨酸

IDON-甲酰尿氨酸

甲酰胺酶

L-犬尿素犬尿素3-羟化酶犬尿素酶3-羟基犬尿酸

邻氨基苯甲酸犬尿素酶

非特异性羟化

羟基氨基苯甲酸

氧化酶

喹啉酸第8页,共34页，2024年2月25日，星期天二国内外研究现状：

IshioT等在体外培养实验中发现，外周单核细胞加入肝癌细胞株HepG2或PLC/PRF/5共同培养后，可显著诱导单核细胞中IDOmRNA的表达。外周单核细胞抗肝癌细胞的细胞毒性作用正好与IDOmRNA的表达水平成正比，加入IDO的抑制剂1-甲基色氨酸（1-MT）后可以降低细胞毒性作用。IDO阳性的肝细胞癌病人在肝切除术后，无复发生存率高于IDO阴性的患者。

第9页,共34页，2024年2月25日，星期天二国内外研究现状：KaiS等证明IDO可以增强NK细胞杀伤K562细胞(慢性髓性白血病细胞系)和HepG2细胞的功能。给与1-MT可以降低老鼠NK细胞毒素的活性。

第10页,共34页，2024年2月25日，星期天二国内外研究现状：

GuidoFrumento等证明L-犬尿素、邻吡啶甲酸和喹啉酸等色氨酸代谢产物可以抑制某些淋巴细胞的增殖。此效应在色氨酸缺乏时更为明显。

DariuszPawlak等发现喹啉酸在1000µM/L浓度水平上可以降低HepG2细胞的活性。第11页,共34页，2024年2月25日，星期天二国内外研究现状：

总之，IDO抗肝癌细胞的作用机制尚处于摸索阶段，还有许多值得研究的地方。本课题将主要研究色氨酸在IDO催化下分解生成的几种代谢产物对肝癌细胞的生长和凋亡有何影响。

第12页,共34页，2024年2月25日，星期天研究方案

一研究目的

观察色氨酸经IDO催化后分解生成的各种代谢产物的量及其代谢产物对肝癌细胞的生长及凋亡的影响，为临床治疗肝癌提供新思路。第13页,共34页，2024年2月25日，星期天二研究内容高效液相色谱法测定色氨酸代谢产物的量。肝癌细胞的培养。

MTT法测定代谢产物对HepG2细胞的增值的抑制作用及色氨酸缺乏对这一作用的影响。流式细胞术观察代谢产物对肝癌细胞细胞周期的影响。

第14页,共34页，2024年2月25日，星期天三拟解决的关键问题

1

HepG2细胞的培养

2

从细胞水平来验证色氨酸的代谢产物对肝癌细胞是否有抑制增殖、周期阻滞、诱导凋亡的作用。

3

各代谢产物浓度范围及作用时间的选定均为本试验的技术关键

4利用高效液相色谱法对色氨酸的代谢产物进行定量分析

第15页,共34页，2024年2月25日，星期天四技术路线(第一步）

。

HepG2细胞株

体外培养

细胞浓度达到104/ml

分0.1,1,10，100，1000µM/L浓度加入代谢产物

12h,24h,36h,48h后分别检测

MTT法

HepG2细胞抑制率

统计学分析

第16页,共34页，2024年2月25日，星期天四技术路线（第二步）。

HepG2细胞株

体外培养

细胞浓度达到104/ml

分0.5,5,50，500，5000µM/L浓度加入IDO

12h,24h,36h,48h后分别检测

MTT法

HPLC法

HepG2细胞抑制率各代谢产物的量

统计学分析.

第17页,共34页，2024年2月25日，星期天四技术路线（第三步）

HepG2细胞株

体外培养

细胞浓度达到104/ml

根据统计学分析结果加药，作用一定时间离心沉淀后收集细胞调整细胞浓度为5*106/ml

流式细胞术细胞周期的变化分析结果第18页,共34页，2024年2月25日，星期天六

实验方案

1

细胞培养：HepG2细胞株在DMEM培养液中传代培养。

2

加药：将培养好的HepG2细胞进行胰酶消化，制成104/ml单细胞悬液，置于反应板内，同时加药

第19页,共34页，2024年2月25日，星期天

(1)选定三种代谢产物（L-犬尿素、3-羟基犬尿酸、喹啉酸）进行试验。

色氨酸充足的条件下（30µM/L）,将每种代谢产物分（0.1，1,10，100，1000µM/L）

5个浓度梯度，(12h,24h,36h,48h)4个反应时间，用MTT法测细胞抑制率。绘制时间关系曲线。

另设色氨酸空白组为对照组

第20页,共34页，2024年2月25日，星期天

(2)色氨酸充足的条件下（30µM/L）加入IDO，分（0.5，5,50，500，5000µM/L）

5个浓度梯度(12h,24h,36h,48h)4个反应时间，测细胞抑制率。

并用高效液相色谱法（HPLC）测出三种代谢产物（L-犬尿素、3-羟基犬尿酸、喹啉酸）生成的量。

第21页,共34页，2024年2月25日，星期天

3流式细胞术测定细胞周期：选取某个代谢产物最佳反应浓度和反应时间离心收集细胞，然后调整细胞为5×106/ml，处理后24h内上机分析。

第22页,共34页，2024年2月25日，星期天

4统计学分析：统计描述：均数±标准差表示，析因设计的方差分析，样本之间比较用SNK-Q检验和t检验，P<0.05有统计学意义。数据分析采用SPSS11.0软件。第23页,共34页，2024年2月25日，星期天本课题的创新之处

首次将色氨酸在IDO的催化下分解生成的代谢产物单独作用于HepG2肝癌细胞株，探讨IDO抗肝癌细胞的作用机理，进一步研究其对肝癌的潜在治疗价值，并借此寻找肝癌治疗的新途径。第24页,共34页，2024年2月25日，星期天研究计划及预测进展

2007年3月底之前：在导师的指导下，查阅国内外文献资料，反复论证该课题的可行性、科学性、创新性；全面了解及掌握所需要的试剂等。

2007年4月开始进行预实验，及时解决碰到的具体问题，并撰写综述。

2007年6月后开始正式实验，做好实验纪录。

2007年10月争取完成实验。

2007年11月后整理实验纪录，做统计学处理，撰写科研论文。

第25页,共34页，2024年2月25日，星期天预期研究成果

预计试验结果为色氨酸代谢产物对HepG2细胞有抑制增殖,调节细胞周期的作用,该作用随药物浓度和时间的增加而增强。色氨酸代谢产物有诱导细胞凋亡的作用。色氨酸代谢产物在肝癌治疗上有潜在价值。第26页,共34页，2024年2月25日，星期天

在充分的理论，成熟的实验条件，认真仔细的工作之后，相信能得到满意的结果。即使结果可能不尽人意，也会给以后的研究工作以宝贵的启示。第27页,共34页，2024年2月25日，星期天研究基础

一学术条件：

我院消化科有自己的实验室及科研经验丰富的博士生和硕士生导师进行指导。上几届研究生和导师王琦教授在肝癌有关方面作了大量的基础性研究工作，积累了丰富的理论知识和实践经验。第28页,共34页，2024年2月25日，星期天二实验条件

我院实验室和山西医科大学实验室具备专业的技术人员和所需的各种仪器设备，具有多年的细胞培养经验，色谱法、MTT法、流式细胞术均已成熟，可以确保实验顺利完成。

三所需经费已基本落实。第29页,共34页，2024年2月25日，星期天经费预算

支出科目

金额（万元）

计算根据及理由

1．合计

0．752．科研业务费0．05文献检索打印论文装订3．实验材料费0．40细胞培养试剂4．仪器设备费0．10实验室耗材光镜电镜5．协作费0．10液相色谱分析流式细胞术检测费用等6．研究组织实施费0．10论文交流第30页,共34页，2024年2月25日，星期天主要参考文献：

1.IshioT,GotoS,TaharaK,etal.Immunoactivativeroleofindoleamine2,3-dioxygenaseinhumanhepatocellularcarcinoma[J]JournalofGastroenterologyandHepatology2004Vol19,319-326

2.KaiS,GotoS,TaharaK,etal.Inhibitionofindoleamine2,3-dioxygenasesuppressesNKcellactivityandacceleratestumorgrowth[J].JournalofExperimentalTherapeuticsandOncology2003,3:336-345.

3.KaiS,GotoS,TaharaK,etal.indoleamine2,3-dioxygenaseisnecessaryforcytolyticactivityofnaturalkillercells[J].ScandinavianJournalofImmunology.2004,59:177-182

第31页,共34页，2024年2月25日，星期天4.GuidoFrumento,RitaRotondo,MichelaTonetti,etal.Tryptophan-derivedcatabolitesareresponsibleforinhibitionofTandnaturalkillercellproliferationinducedbyindoleamine2,3-dioxygenase.[J]J.Exp.Med,2002,196(4):459-468.

5.FallarinoF,GrohmanUn,VaccaC,etal.Tcellapoptosisbytryptophancatabolis