细胞凋亡与细胞衰老

关于细胞凋亡与细胞衰老第一节程序性细胞死亡单细胞生物而言，细胞死亡既是个体死亡。多细胞生物细胞死亡并非意味着个体死亡。相反在多细胞生物发育中，必须通过细胞死亡进行形态建成。正常的组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。第2页,共42页，2024年2月25日，星期天温和式：细胞凋亡（apoptosis）、细胞自噬（autophagy）。激烈式：细胞坏死（necrosis）（一）细胞坏死概念——细胞受到环境因素的严重伤害，如极端的物理化学因素和眼中的病理性刺激引起细胞死亡的现象。坏死原因——蛋白变性，DNA严重损伤，ATP缺乏，溶酶体破裂等。细胞死亡的方式第3页,共42页，2024年2月25日，星期天细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。随坏死进程，细胞质呈强嗜酸性，苏木精/伊红染色呈均一红色。细胞膜不完整，台盼蓝染色阳性(活细胞不着色)。DNA随机降解，细胞内容物流出，引起炎症。第4页,共42页，2024年2月25日，星期天通过形成自噬泡与胞内溶酶体融合，消化细胞自身结构，自噬一般是细胞维持存活的手段，但过多自噬导致细胞死亡。细胞自噬是正常的生理过程。也发生在细胞营养匮乏及个体发育过程中，如昆虫变态。细胞自噬可能与细胞凋亡一样在动物发育过程中形态建成中扮演重要角色。是由细胞自身基因控制的程序性死亡。（二）细胞自噬第5页,共42页，2024年2月25日，星期天（三）细胞凋亡细胞凋亡是多细胞生物正常的过程，是一种由基因控制的主动的细胞生理性自杀行为。第6页,共42页，2024年2月25日，星期天第一节程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)——指在生长发育过程中细胞在基因调控下，按照一定时空顺序发生的生理性死亡。细胞凋亡是形态学的概念，程序性细胞死亡是功能上的概念。第7页,共42页，2024年2月25日，星期天一、动物细胞的程序性细胞死亡（一）细胞凋亡（apoptosis）1动物细胞凋亡形态特征1)凋亡的起始细胞膜：完整，表面特化结构消失，细胞间接触消失细胞质：线粒体形态变化不大，核糖体从内质网解离，内质网膨胀，溶酶体活性不增加。细胞核：染色质靠边、固缩，细胞核变型突出，染色质断裂。2）凋亡小体的形成整个细胞：通过出芽（发泡）的方式形成许多凋亡小体，凋亡小体内有结构完整的细胞器；3）凋亡小体被临近细胞或体内吞噬细胞吞噬消化第8页,共42页，2024年2月25日，星期天2凋亡的生化特征①无细胞质外泄，不引起炎症反应；②核酸内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图呈梯状；③tTG（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平；④质膜PS（磷酯酰丝氨酸，phosphatidylserine)外翻。

凋亡通常是生理性变化，坏死是病理性变化。第9页,共42页，2024年2月25日，星期天坏死凋亡第10页,共42页，2024年2月25日，星期天第11页,共42页，2024年2月25日，星期天第12页,共42页，2024年2月25日，星期天第13页,共42页，2024年2月25日，星期天1.形态学，电镜，光镜；2.DNA凝胶电泳——ladder；3.流式细胞计；4.核酸内切酶活力检测；5.彗星电泳法；6.AnnexinV检测细胞膜外表面PS；7.TUNEL技术（末端脱氧核苷酸转移酶标记法）。3细胞凋亡的检测方法第14页,共42页，2024年2月25日，星期天常用检测细胞凋亡的染料：二乙酸荧光素（FDA），绿色荧光，活细胞染色。Hoechst33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的细胞荧光较强。溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放线菌素D（7‐AAD），不通透，正常和凋亡细胞拒染。各种碱性染料。固定后染细胞核。可用不同性质的染料对凋亡细胞进行双染色。第15页,共42页，2024年2月25日，星期天A：人类白血病T细胞经1微升喜树碱处理，早期凋亡特异性的特征被荧光标记的Annexin－5(Ca2+依赖性磷脂结合蛋白)检测到(产生凋亡小体的黄色绿色细胞)。晚期凋亡和坏死细胞被pi染色（橙红色细胞核）。细胞凋亡的发生伴有细胞膜磷脂酰丝氨酸移位酶的激活，提示细胞膜膜脂双层的某些成分由胞浆面向细胞质面外翻，可能是细胞凋亡的早期征象。B：人白血病细胞株HL-60cells（急性粒细胞白血病，p53缺陷）被喜树碱诱导3小时。DNA段端被荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶标记。

AB第16页,共42页，2024年2月25日，星期天（1）生理学意义

①确保正常发育、生长：清除多余的、失去功能价值的细胞（指趾间组织细胞）；

②维持内环境稳定：清除受损突变细胞，自身反应细胞，衰老细胞；

③发挥积极的防御功能：感染病毒细胞凋亡，阻止病毒复制。4细胞凋亡的生理和病理学意义第17页,共42页，2024年2月25日，星期天发育中的小鼠趾间细胞凋亡第18页,共42页，2024年2月25日，星期天神经细胞与靶细胞联系建立的过程中多余的神经细胞凋亡第19页,共42页，2024年2月25日，星期天（2）病理学意义①病原体侵染；–诱导凋亡——HIV–抑制凋亡——天花病毒②细胞凋亡不足–肿瘤，自身免疫疾病；③细胞凋亡过度–神经退行性疾病（AD，帕金森症）、心肌梗塞、再生障碍性贫血、骨组织坏死。第20页,共42页，2024年2月25日，星期天（二）细胞凋亡的分子机制1诱发凋亡的因素细胞之所以凋亡是因为细胞受到温和胁迫、衰老、其他细胞的刺激或者细胞接受不到外界生长存活信号。诱导凋亡的因素分两大类：

物理因素：射线、温和的热激、冷激、渗透胁迫。

化学因素：活性氧、钙离子、视黄醛、细胞毒素、凋亡细胞因子等。细胞接受死亡信号后主要通过两种途径实现细胞凋亡——蛋白酶Caspase依赖型细胞凋亡：激活的Caspase切割靶蛋白导致细胞凋亡；非Caspase依赖型细胞凋亡：可同时激活。第21页,共42页，2024年2月25日，星期天2Caspase依赖性细胞凋亡Caspase的发现和秀丽隐杆线虫程序性细胞死亡研究有关。秀丽隐杆线虫是研究PCD的理想材料（1mm长，透明，3.5天即可有合子发育成熟，细胞总共产生1090个细胞，其中131个凋亡）。控制线虫PCD的基因有：Ced-3、Ced-4和Ced-9等。哺乳动物中线虫相关基因（蛋白）研究发现10多种Caspase。–Ced-3和Ced-4诱发凋亡；–Ced-9抑制Ced-3、Ced-4的作用。其中Caspase1与线虫Ced-3同源。负责白介素活化，调节免疫，亦有促使细胞凋亡功能。第22页,共42页，2024年2月25日，星期天植物气孔Caspase的性质Caspase（天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶）——是存在于细胞质中结构类似的一类蛋白酶，具有有限切割靶蛋白的功能，切割位点在靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。Caspase激活——自身切割或其他Caspase切割，产生两段肽段形成有蛋白酶活性的二聚体。Caspase家族——可分为起始Caspase、执行Caspase和炎症反应介导因子。结构：起始Caspase多含有死亡效应结构域（DED）或Caspase募集结构域（CARD)。

起始Caspase——负责接受死亡信号，激活执行Caspase。同性活化。

执行Caspase——激活后切割靶蛋白，引起凋亡效应。异性活化。第23页,共42页，2024年2月25日，星期天同性活化（homo‐activation)——即酶原分子聚集成复合物达到一定浓度时，就彼此切割或者构象改变产生有活性的二聚体形式。起始Caspase中，Caspase‐8和10具有死亡效应结构域，而Caspase‐2和9具有募集结构域，通过结构域之间的聚合，Caspase能够彼此结合或与接头蛋白（adaptor）结合，被招募到上游信号复合物中发生同性活化。异性活化（hetero‐activation）——即起始Caspase招募执行Caspase酶原分子后，对其进行切割，产生具有活性的执行Caspase，切割细胞内重要的结构和功能蛋白，导致细胞死亡。第24页,共42页，2024年2月25日，星期天Caspase家族第25页,共42页，2024年2月25日，星期天Caspase活化Caspase在正常的状态下，它们以无活性的原酶（proenzymes）形式存在。Caspase被同一Caspase特异性的在两个亚基连接处的天冬氨酸位点剪切，同时释放N-端结构域后被激活。激活的上游的Caspase能依次地激活其它下游的Caspase，形成Caspase级联反应，将凋亡信号一级级传至凋亡底物。第26页,共42页，2024年2月25日，星期天死亡受体起始的外源途径——死亡信号来自细胞外促调亡细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）等与细胞表面死亡受体（TNF-R、Fas）的结合。线粒体起始的内源途径——细胞内部或外部死亡信号导致细胞色素c从线粒体游离出来进入细胞质，触发内源凋亡途径。3Caspas依赖性细胞凋亡的外源途径和内源途径第27页,共42页，2024年2月25日，星期天

死亡受体介导的细胞凋亡起始于死亡配体与受体的结合。死亡配体主要是肿瘤坏死因子（TNF）家族成员。TNF是一种具有多种生物学效应的细胞因子，能够使肿瘤组织出血坏死。死亡配体的生物学功能是通过与细胞表面的受体结合来实现的，TNFR1和Fas是死亡受体家族的典型代表。死亡受体起始的外源途径Fas又称作APO-1，属TNF受体家族。•1993年人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。•Fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白。•Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合激活Caspase。第28页,共42页，2024年2月25日，星期天Fas诱导的细胞凋亡外源途径（细胞表面死亡受体介导的细胞凋亡通路）①死亡信号（肿瘤坏死因子）与死亡受体结合（TNF的受体Fas）三聚化；②死亡受体结合胞内的DD区（Deathdomain）与接头蛋白FADD的DD区结合③FADDN端通过DED区（deatheffectordomain）与原Caspase-8蛋白结合，促进Caspase-8聚集形成死亡信号诱导复合体。④Caspase-8自剪切活化，激活Caspase-3、Caspase-7；Caspase-3激活Caspase-6。⑤Caspase切割降解关键性蛋白，包括结构蛋白、蛋白激酶、转录调控蛋白和周期蛋白、核纤层蛋白等等）。Caspase还可降解Dnase的抑制蛋白，释放Dnase，降解DNA。⑥细胞凋亡第29页,共42页，2024年2月25日，星期天①信号激发活化了Bax凋亡基因，凋亡基因与抗凋亡基因BCL-2结合抑制了抗凋亡基因的作用，引起线粒体电压依赖性阴离子通道（VDAC）打开，细胞色素C被释放到胞质中；②释放的细胞色素C与Apaf-1（凋亡蛋白酶激活因子,是线虫Ced-4基因哺乳细胞中的同源物）结合激活Caspase-9，后者再激活Caspase-3、6等，引起细胞凋亡。线粒体起始的内源途径：（线粒体为核心的细胞凋亡通路）第30页,共42页，2024年2月25日，星期天第31页,共42页，2024年2月25日，星期天含有1-4个Bcl-2同源结构域（Bcl-2homology）（BH1-4）。分两类：抗凋亡蛋白（anti-apoptoticprotein)和促凋亡蛋白（pro-apoptoticprotein)。•促凋亡蛋白能引起线粒体外膜通透性改变，导致cytc释放，引起凋亡。•Bcl-2相当于线虫的ced9。主要定位于线粒体膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。Bcl-2基因家族（B-celllymphomagene2family)第32页,共42页，2024年2月25日，星期天凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1，Apaf-1）：线虫的同源物为ced-4。•作用：参与线粒体凋亡途径，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。•Apaf-1与cytc、ATP/dATP结合后，召集caspase-9，形成凋亡复合体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。第33页,共42页，2024年2月25日，星期天途径：（1）细胞接受调亡信号后，Bax,Bak形成二聚体从细胞质移到线粒体外膜，打开一种阴离子通道，细胞色素C从线粒体进入细胞质。（2）细胞色素C与Apaf-1结合，使Apaf-1聚合并通过其N端CARD结构域募集Caspase9形成凋亡复合体，Caspase9同性活化。（3）活化的Caspase9进一步活化执行Caspase引起细胞凋亡。第34页,共42页，2024年2月25日，星期天4Caspase非依赖型细胞凋亡细胞剔除Caspase基因仍能凋亡，推测细胞内存在不依赖于Caspase的凋亡途径，但机制尚不清楚。线粒体在Caspase非依赖型细胞凋亡中可能也发挥关键性作用，除CytC，线粒体能够向细胞质内释放多个凋亡相关因子，引发Caspase非依赖的细胞凋亡。凋亡诱导因子（AIF）：位于线粒体外膜。凋亡时移到核中，激活某种核酸内切酶引起染色质凝集断裂。限制性核酸内切酶G（EndoG）：位于线粒体内，修复线粒体DNA。凋亡时进入核中剪切DNA产生200bp单位片段。第35页,共42页，2024年2月25日，星期天凋亡诱导因子（apoptosis-inducingfactor，AIF）是一类存在于线粒体内外膜间隙的保守的黄素蛋白，具有双重功能。在细胞正常的生理状态下，AIF作为线粒体氧化还原酶，能催化细胞色素c（Cyt-c）和NAD之间的电子传递，当细胞受到凋亡的刺激时，线粒体膜通透性改变，AIF从线粒体转位到核内，引起细胞染色体的凝聚和DNA50kb的片段化。核酸内切酶G(endoG)是一种线粒体特异的核酸酶，负责线粒体DNA的修复与复制，在细胞凋亡时转位到细胞核。核酸内切酶G能不依赖于将DNA切割成核小体片段。第36页,共42页，2024年2月25日，星期天5细胞凋亡调控凋亡相关的基因和蛋白——Caspase抑制因子：抑制凋亡。IAP家族（inhibitorofapoptosis,凋亡抑制子）：有BIR结构域，可直接与Caspase结合，抑制其活性。有7个成员，如：c-IAP1等。c-FLIP(FADD样Caspase抑制蛋白）、BAR、ARC（含CARD结构域的凋亡抑制子）：可与接头蛋白等相互作用阻断死亡信号传递到Caspase。病毒编码c-FLIP同源蛋白v-FLIP：结构作用类似c-FLIP。含有的DED结构域与FADD结合，阻止Caspase与FADD结合。Caspase抑制因子的抑制因子：促进调亡。IAP抑制蛋白：结合IAP，释放Caspase。如线粒体释放的Smac、Omi。第37页,共42页，2024年2月25日，星期天细胞存活因子：包括多种有丝分裂原和生长因子他们与细胞表面的受体结合，启动胞内信号途径，抑制凋亡的发生。与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基都参于对细胞凋亡的凋控，研究较多的有NF-κB、p53、ATM等：NF-κB（nuclearfactorκB）：凋亡抑制因子。多种生长因子通过磷脂酶C-PKC途径磷酸化抑制因子IκB（inhibitorκB)从而激活NF-κB，NF-κB进入核中激活转录c-IA