药物制剂的微生物学检查

关于药物制剂的微生物学检查微生物与药学的关系密切1、许多抗生素是微生物的代谢产物,2、选用微生物来制造医药卫生方面广泛应用的药物,如维生素,辅酶；3、药品卫生质量的控制需要进行微生物学检验；4、药品和生物制剂应用生物工程技术生产时，采用工程菌进行，如：胰岛素、干扰素和生长因子等。第2页,共48页，2024年2月25日，星期天3基本概念灭菌(sterilization)：应用物理或化学等方法将物体上或介质中所有微生物繁殖体及其芽孢全部杀灭或除去的手段。无菌(sterility)：在任一指定的物体、介质或环境中无任何活的微生物。无菌操作(aseptictechnique)：在整个操作中利用或控制一定的条件，使产品避免被微生物污染的一项操作方法和技术。第3页,共48页，2024年2月25日，星期天4空气净化技术是以创造洁净的空气为主要目的的空气调节措施。空气净化分工业净化(尘埃粒子)和生物净化(尘埃粒子和微生物)。药物制剂行业中的空气净化需要生物净化，即在除掉空气中的各种尘埃的同时除掉各种微生物等。空气净化技术是以创造洁净的空气为主要目的的空气调节措施。空气净化分工业净化(尘埃粒子)和生物净化(尘埃粒子和微生物)。药物制剂行业中的空气净化需要生物净化，即在除掉空气中的各种尘埃的同时除掉各种微生物等。洁净级别尘粒数(粒/升)粒径

0.5

m尘粒数(粒/英尺3)粒径

0.5

m温度(℃)相邻级别室间压差湿度(%)菌落数100

3.5

10018-26正压40-60<110000

350

10000<3100000

3500

100000<10＞100000

35000

1000000/第4页,共48页，2024年2月25日，星期天1.掌握药物的体外试菌试验方法（琼脂扩散法和系列稀释法），了解药物的体内抗菌实验。2.掌握一般灭菌制剂的无菌检查方法和原理，熟悉特殊药品的无菌检查法。3.掌握非灭菌药物的微生物总数测定方法，熟悉药品的大肠杆菌检查方法。4.了解一般药品的沙门菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风杆菌的检查方法。第5页,共48页，2024年2月25日，星期天第一节药物的抗菌试验第二节灭菌制剂的无菌检查第三节药物的微生物限度检查第6页,共48页，2024年2月25日，星期天药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或杀菌药物的抑菌试验；测定药物杀菌活性的杀菌试验；以及检查两种药物联合作用的联合抗菌试验等。一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物能杀死微生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能生长。第一节药物的抗菌试验第7页,共48页，2024年2月25日，星期天药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对而言的。在我们检测时，药物的作用受到用药时培养基的组成、温度、PH值及所用的菌种、菌量等各个因素有关。一般我们在体外对药物进行测试后，有效的药再要进行体内试验，如果体内试验再次证实此药有效的话，才能推荐应用到临床。第8页,共48页，2024年2月25日，星期天一、药物的体外抑菌试验（一）体外抑菌试验药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用连续稀释法和琼脂扩散法。

1、连续稀释法包括液体培养基稀释法和固体培养基稀释法两种。均可以用来测定药物的最小抑菌浓度(MIC)。

MIC:是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg/ml或U/ml表示。第9页,共48页，2024年2月25日，星期天（1）液体培养基稀释法在试管中用液体培养基进行2倍系列稀释药物，后在每一管中加入定量的试验菌液，经24~48h培养后观察结果。以能抑制试验菌生长的最低浓度为药物的MIC。（2）固体培养基稀释法平板法：测定多种细菌对同一药物的MIC

斜面法：较长时间培养的试验菌和霉菌。第10页,共48页，2024年2月25日，星期天

2、琼脂扩散法利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长的原理进行的。一般用于细菌和酵母菌的药敏试验。（1）滤纸片法（纸碟法）滤纸片法是最常用的方法，可在1个平板上测定多种药物对同一试验菌的抗菌作用；适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。第11页,共48页，2024年2月25日，星期天滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌环的直径的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感(S)，中介(I)还是耐药(R)？国际标准采用K-B法：水解酪蛋白培养基和卡尺第12页,共48页，2024年2月25日，星期天世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断，比如：抗生素抑菌圈直径（mm）耐药中敏敏感氯霉素≤1213-17≥18红霉素≤1314-17≥18四环素≤1415-18≥19卡那霉素≤1314-17≥18第13页,共48页，2024年2月25日，星期天（2）挖沟法适用于测试一种药物对几种细菌的抗菌作用。方法是先制备普通琼脂平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧接种细菌。经过培养以后观察家细菌生长的情况。我们可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。第14页,共48页，2024年2月25日，星期天(二)体外杀菌试验杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性的。1、最低杀菌浓度(MBC)(最小致死浓度MLC)

按液体培养基稀释法的操作方法测了药物的MIC。然后把未长出菌的各个试管培养液分别移种到无菌平板上，培养后凡是平板上无菌生长的药物最低浓度就是MLC。如果是细菌的话可以称为MBC。第15页,共48页，2024年2月25日，星期天2、

活菌计数法活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作用后混合液稀释后，混入琼脂培养基做成平板，培养后数平板上形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖而来的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合液中存活的细菌数。或者也可以用微孔滤膜过滤药物与试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培养后数菌落数。第16页,共48页，2024年2月25日，星期天3、

酚系数测定（石炭酸系数测定）这种方法仅仅适用于酚类消毒剂杀菌效力的测定。酚系数是以酚为标准，将待测的化学消毒剂与杀菌效力相比较，所得的就是杀菌效力的比值。具体的测定方法是分别将酚及待测化学消毒剂按不同比例稀释，各取5ml放到试管中，再加入经24小时培养后的菌悬液各0.5ml，混匀后放入20℃水浴中，5、10、15分钟分别取一接种环混合液移种到另一支5ml的肉汤培养基中，37℃培养24小时记录生长情况。第17页,共48页，2024年2月25日，星期天（三）联合抗菌试验联合抗菌试验主要用于测定两种或以上抗菌药物联合应用时的相互影响。抗菌药联合应用时抗菌作用加强的称为协同作用；等于两药单独抗菌活性成为相加作用；抗菌作用减弱的称为拮抗作用；相互无影响的称为无关作用；常用的联合抗菌试验的方法有以下2种。第18页,共48页，2024年2月25日，星期天1、棋盘格法棋盘稀释法是常用的定量方法，首先分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的MIC。药物最高浓度为MIC的2倍，对倍稀释。两种药物的稀释分别在方阵的纵列和横列进行，这样在每管（孔）中可得到不同浓度组合的两种药物混合液。接种菌量为5×105CUF／ml，35℃孵育18h~24h后观察结果。计算部分抑菌浓度（FIC）指数。第19页,共48页，2024年2月25日，星期天药物及浓度青霉素G(IU／m1)

链霉素单药对照

4210.50.25链霉素（µg／ml）

64------32------16-----

-8---+++4---+++青霉素G单药对照

---++细菌对照-：无细菌生长+：有细菌生长

FIC指数=1／1+16／16=2——无关﹤0.5为协同作用；0.5－1为相加作用；1～2为无关作用；﹥2为拮抗作用。第20页,共48页，2024年2月25日，星期天[棋盘法的设计]棋盘法的主要优点在于甲、乙两药的每个药物浓度都有单独的和与另一个药物不同浓度的联合，因此能精确测定两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用。在进行棋盘法之前应先测定两种抗菌药物单独对受试菌的MIC，然后以两药MIC的8倍、4倍、2倍、1倍以及MIC的1/2、1/4、1/8浓度（或4倍、2倍、1倍、1/2、1/4浓度）分别进行联合。可见举例，如表—1的青霉素G与链霉素联合药敏实验和表2的TMP+SMZ的联合作用。第21页,共48页，2024年2月25日，星期天联合药物敏感试验和杀菌试验的意义①治疗混合性感染；②预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生；③联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量；④联合用药比单一用药时效果更好。

第22页,共48页，2024年2月25日，星期天2、琼脂扩散纸条法将两种含药纸片贴于已涂布试验菌的MH琼脂平板表面，培养24h后观察结果。培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判断两药联合应用时，是无关、相加、协同还是拮抗作用（P148）。第23页,共48页，2024年2月25日，星期天二、药物的体内抗菌试验药物的体内抗菌试验又称为动物试验治疗试验或保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。因此在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还需要做体内的抗菌试验。设立对照组第24页,共48页，2024年2月25日，星期天三、影响抗菌试验的因素

1、试验菌：常用细菌、霉菌和酵母菌的标准菌株；特殊情况下用分离株（传代次数；对数期）2、培养基：按各试验菌的营养要求进行配制，严格控制各种原料、成分的质量及培养基的配制过程；不能含有降低药物活性的成分或对抗物。第25页,共48页，2024年2月25日，星期天3、抗菌药物：药物的物理状态、浓度、稀释方法等都会直接影响抗菌试验的结果，必需精确配制。（均质；PH值为中性；中草药）4、对照试验：为确保试验结果的科学性和准确性，试验时应同时进行各种对照试验。

试验菌对照-在无药情况下，应能在培养基内正常生长。

溶剂及稀释液对照-配制抗菌药物时所用的溶剂及稀释液均应无抗菌作用。

已知药物对照-应使已知抗菌药物对标准菌株出现抗菌效应。第26页,共48页，2024年2月25日，星期天灭菌和无菌制剂：直接注入体内或直接接触创伤面、粘膜等的一类制剂。灭菌制剂：采用某一物理或化学方法将杀灭或除去所有活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。无菌制剂：采用某一无菌操作方法或技术制备的不含任何活的微生物繁殖体和芽孢的一类药物制剂。第二节灭菌制剂的无菌检查法第27页,共48页，2024年2月25日，星期天

需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围

各种注射剂：用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用的无菌水、输液、注射剂原液等。眼用及外伤用制剂：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、溃疡和烧伤等外科用药制剂。外科用的敷料、器材：如外科手术用的脱脂棉、纱布、缝合线及一次性注射器与一次性无菌手术刀片、输血袋等。植入剂：用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、免疫药物及抗肿瘤药物等无菌的制剂。可吸收的止血剂：如凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种药物制剂。第28页,共48页，2024年2月25日，星期天一、无菌检查的基本原则1、严格的无菌操作：环境+操作2、建立方法的验证：适合的检查方法3、相关试剂及培养条件：供试品+三种培养基+

合适温度4、正确的采样：随机+采样量和比例5、结果判断：任一不合格则不合格第29页,共48页，2024年2月25日，星期天二、无菌检查方法验证试验

方法验证可与供试品的无菌检查同时进行（一）试验菌株：代次+保藏技术（二）培养基：需氧菌+厌氧菌+真菌培养基（三）稀释液与冲洗液：灭菌（四）验证试验方法：菌液制备薄膜过滤法直接接种法结果判断第30页,共48页，2024年2月25日，星期天三、无菌检查的基本方法（一）供试品的检查数量与检验量每批产品数量每种培养基最低检验量注射剂＜10010%或最少4个100-50010瓶（支）＞5002%或最多30个眼用及其他非注射产品＜＝4每个容器＜2005%或最少2个＞＝20010个桶装固体原料5-5020%或最少4个＞502%或最少10个第31页,共48页，2024年2月25日，星期天供试品检查的接种量、培养基装量和取供试品

中国药典2000版

单位：ml供试品装量每管接种量直接接种法培养基量薄膜过滤法接种培养基量取供试品数(瓶、支)1或1以下全量15112-5以下半量15115-20以下2151120-50以下5401150-100以下(静脉)全量-1005100-500全量-1005500以上500-1005无菌粉针剂11无菌粉末原料6份各0.5g第32页,共48页，2024年2月25日，星期天阳性对照菌需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌CMCC(B)28001厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌CMCC(B)64941真菌阳性对照菌：白色念珠菌CMCC(F)98001或曲霉菌ATCC16404第33页,共48页，2024年2月25日，星期天无菌检查法直接接种法：适用于非抗菌作用药物检查薄膜过滤法：适用于有抗菌作用的或大容量的供试药物检查第34页,共48页，2024年2月25日，星期天各种培养基种类、数量及培养温度和时间

《中国药典》2000版培养基种类培养温度（℃）培养时间d培养基数量试验管（支）阳性对照（支）阴性对照（支）需氧菌30-355211厌氧菌30-365211真菌20-257511第35页,共48页，2024年2月25日，星期天无菌检查结果分析供试品需氧菌厌氧菌真菌对照试验结果判定备注阳性阴性4______+_合格2+－____+_不合格重新取样复试2次仍有菌生长，判不合格3__+－__+_不合格4____+－+_不合格5________重做按特殊药品检查6+－+－__++培养基染菌或操作不严格更换培养基，重检并严格无菌操作第36页,共48页，2024年2月25日，星期天第三节非灭菌制剂的微生物限度检查法微生物限度检查项目内容：染菌量的检查细菌数霉菌数酵母菌数控制菌的检查大肠埃希氏杆菌(大肠杆菌)金黄色葡萄球菌沙门氏菌铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)破伤风杆菌活螨的检验第37页,共48页，2024年2月25日，星期天中国药典2000版二部微生物限度标准

(单位：个/g或个/ml)表1编号剂型细菌数霉菌·、酵母菌数大肠杆菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌1片剂1000100-2酊剂100100-3胶囊剂1000100-4软膏剂100100--5一般眼膏剂100---6一般滴眼剂100---7丸剂(滴丸、糖丸等)1000100-8气雾剂10010---9糖浆剂100100-第38页,共48页，2024年2月25日，星期天

中国药典2000版二部微生物限度标准

(单位：个/g或个/ml)表2编号剂型细菌数霉菌、酵母菌数大肠杆菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌10膜剂100/10cm2100/10cm2---11颗粒剂1000100-12口服溶液剂、混悬剂、乳剂100100-13散剂外用散剂1000100100---14滴耳剂10010--15滴鼻剂10010---16洗剂100100--17搽剂100100--18凝胶剂100100---第39页,共48页，2024年2月25日，星期天一、染菌量的检查目的细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所污染的活细菌数，来判明供试品被细菌污染的程度。霉菌与酵母菌数的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活的霉菌和酵母菌数，以此来判明供试品被真菌污染的程度。测定的方法细菌总数的测定营养琼脂平板培养基

+0.001%三苯四唑氯化物（TTC）霉菌总数的测定玫瑰红钠（马丁）培养基第40页,共48页，2024年2月25日，星期天

控制菌的检查口服制剂中不能检出大肠杆菌脏器口服制剂不得检出沙门氏菌和大肠杆菌一般外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不得检出破伤风杆菌。第41页,共48页，2024年2月25日，星期天大肠杆菌的检验供试