药品质量标准分析方法验证

关于药品质量标准分析方法验证第十二条质量控制的基本要求：（四）检验方法应当经过验证或确认；第一百三十九条企业的厂房、设施、设备和检验仪器应当经过确认，应当采用经过验证的生产工艺、操作规程和检验方法进行生产、操作和检验，并保持持续的验证状态。第一百四十二条当影响产品质量的主要因素，如原辅料、与药品直接接触的包装材料、生产设备、生产环境（或厂房）、生产工艺、检验方法等发生变更时，应当进行确认或验证。必要时，还应当经药品监督管理部门批准。第一百四十三条清洁方法应当经过验证，证实其清洁的效果，以有效防止污染和交叉污染。清洁验证应当综合考虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及相应的取样回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素。第一部分：药品质量标准分析方法验证法规要求：药品生产质量管理规范第2页,共75页，2024年2月25日，星期天第一百四十七条应当根据确认或验证的对象制定确认或验证方案，并经审核、批准。确认或验证方案应当明确职责。第一百四十八条确认或验证应当按照预先确定和批准的方案实施，并有记录。确认或验证工作完成后，应当写出报告，并经审核、批准。确认或验证的结果和结论（包括评价和建议）应当有记录并存档。第一百四十九条应当根据验证的结果确认工艺规程和操作规程。第一百六十二条质量标准、工艺规程、操作规程、稳定性考察、确认、验证、变更等其他重要文件应当长期保存。第二百二十三条物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求：（一）企业应当确保药品按照注册批准的方法进行全项检验；（二）符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：第一部分：药品质量标准分析方法验证法规要求：药品生产质量管理规范第3页,共75页，2024年2月25日，星期天1.采用新的检验方法；2.检验方法需变更的；3.采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法；4.法规规定的其他需要验证的检验方法。（三）对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠；（四）检验应当有书面操作规程，规定所用方法、仪器和设备，检验操作规程的内容应当与经确认或验证的检验方法一致；第二百三十条产品的放行应当至少符合以下要求：（一）在批准放行前，应当对每批药品进行质量评价，保证药品及其生产应当符合注册和本规范要求，并确认以下各项内容：1.主要生产工艺和检验方法经过验证；第一部分：药品质量标准分析方法验证法规要求：药品生产质量管理规范第4页,共75页，2024年2月25日，星期天方法验证就是根据检验项目的要求，预先设置一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所采用分析方法是否符合检验项目的要求。•建立质量标准时，应对分析方法中的各检验项目进行完整的验证；•当药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法修订时，可根据变更的内容决定对分析方法进行部分验证还是完整的验证；•当原料药合成工艺发生变更时，可能引人新的杂质，杂质检査方法和含量测定方法的专属性就需要进行验证，以证明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成分的含量测定应无干扰；•当质量标准中某一项目分析方法发生部分改变时，如采用高效液相色谱法测定含量时，检测波长发生改变，则需要重新进行检测限、定量限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证，证明修订后的分析方法的合理可行；•当变更达到一定程度时，则需要完整的验证。如分析方法完全改变，则应按新方法进行完整的验证。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第5页,共75页，2024年2月25日，星期天方法验证的一般原则：通常情况下，分析方法需进行方法验证。对于仅需按照实验室日常测试操作步骤即可测定的检验项目不需要进行验证，如外观、崩解时限、密度、重量、pH值、灰分、装量等。方法验证的内容应根据检验项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。同一分析方法用于不同的检验项目会有不同的验证要求。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第6页,共75页，2024年2月25日，星期天需要验证的检验项目检验项目是为控制药品质量，保证药品安全有效而设定的测试项目。根据检验项目的设定目的和验证内容的不同要求，将需验证的检验项目分为四类：•鉴别试验；•杂质的限度检查；•杂质的定量测定；•含量测定，包括原料药或制剂中有效成分的含量，制剂中其他成分（如防腐剂等）的含量，溶出度与释放度等检查中的溶出量，以及含量均匀度。除此之外还有一些物理项目的检测如粒径分布、旋光度、熔点和硬度，其要求与其他检验项目有所不同，通常其分析方法验证应有不同的要求。鉴别的目的在于判定被分析物是目标化合物，而非其他物质。用于鉴别的分析方法要求具有较强的专属性和耐用性。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第7页,共75页，2024年2月25日，星期天杂质检査主要用于控制主成分以外的杂质，如无机杂质、有机杂质等。杂质检查分为限度检査和定量测定两部分。用于限度检査的分析方法验证侧重专属性、检测限和耐用性。用于定量测定的分析方法验证强调专属性、准确度、精密度、线性、范围、定量限和耐用性。含量测定对准确度要求较高，因此所采用的分析方法要求具有一定的专属性、准确度和线性等要求。《中国药典》2010年版中规定了不同的检验项目需要验证不同的内容，详见下表：第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第8页,共75页，2024年2月25日，星期天检验项目和验证内容第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证验证内容检验项目鉴别杂质测定含量测定定量限度准确度否是否是精密度重复性否是否是中间精密度否是*否是*专属性**是是是是检测限否是***是否定量限否是否否线性否是否是范围否是否是耐用性是是是是备注：1.*:已有重现性验证，不需验证中间精密度；2.**：如一种方法不够专属，可由其他分析方法予以补充；3.***：视具体情况予以验证；4.“是”代表该项内容需要验证，“否”代表该项内容不需要验证。第9页,共75页，2024年2月25日，星期天方法验证内容（本次主要介绍HPLC法含量测定方法的验证过程）1、色谱方法开发流程主要包括以下步骤：选择分离模式选择色谱柱和填料规格选择流动相溶剂如果分离模式需要，调节流动相的pH值进行等度或梯度初步实验，以确定边界条件优化实验条件第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第10页,共75页，2024年2月25日，星期天模式选择通常分离模式是由以上因素决定：目标物的类型和溶解度、目标物分子量（MW）、样品基质以及可使用的固定相和色谱柱。如：分子量＜2000在有机相中选择正相、反相，在水相中选择反相、离子对试剂反相或离子交换；分子量＞2000在有机相中可选择凝胶渗透，在水相中选择凝胶过滤、大孔填料的离子交换或大孔填料的反相色谱。又如：在水相/有机相中单糖和二糖可采用正相氨基、离子交换，多环芳烃采用反相C18，有机酸采用配位相互作用反相离子对，碱性、极性化合物采用极性反相C8、C18或反相C18离子抑制，位置异构体采用反相C8，强极性化合物采用HILIC模式；在有机相非极性化合物采用正相Si，极性化合物采用正相氨基、氰基。在水相中合成的多分散性聚合物并限定分子量范围采用体积排阻，合成多肽采用反相，聚合物采用水相GPC，重组多肽和Pr采用反相、阴离子或阳离子交换；在有机相中合成的多分散性聚合物和其它可溶于有机溶剂的聚合物采用凝胶渗透，低聚物采用反相。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第11页,共75页，2024年2月25日，星期天选择色谱柱和填料规格通常我们需考虑色谱柱固定相孔径、填料的粒径、长度和内径。要进行高通量分析可采用小粒径短柱（如亚2μm）若对包括多种组分的样品进行复杂的分离，可以选择小颗粒长柱。若要进行高灵敏度分析可采用2.1mm内径的色谱柱。填料的孔径非常用重要，因为待测分子必须与多孔结构“相匹配”，才能与固定相发生相互作用。较小孔径的填料（孔径80到120Å）适合分离分子量2000以下的小分子，对于分子量超过2000的较大分子，需要使用较大孔填料；例如：分离Pr的常孔径是300Å。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第12页,共75页，2024年2月25日，星期天选择流动相溶剂（介绍反相）流动相主要由两部分组成：1、水：可含缓冲液，或用酸或碱调节pH值2、可与水混溶的有机溶剂反相色谱有多种用途，有时在同一色谱分析中就可以分离非极性、极性、可离子化的和离子型分子。一般来说，对于可离子化的化合物，为了增加保留和改善峰形，我们会在流动相中加入改性剂，以抑制离子化，减弱其极性，使其保留更强。一般来说，反相LC的流动相包括水（190nm）和作为改性剂的乙腈（190nm）或甲醇（205nm）,不太常用的改性剂还有四氢呋喃（THF212nm）和异丙醇（205nm）。选择性差异和样品的保留都会因流动相不同而明显改变。样品溶解度也很可能不同，需要使用特殊的溶剂或多种溶剂。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第13页,共75页，2024年2月25日，星期天在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化。在这类反相系统中，控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第14页,共75页，2024年2月25日，星期天用流动相改性剂控制pH流动相pH对色谱分离的影响有多种方式。根据所分析的化合物，pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。如果是酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。了解分析物的pKa，才能够有效地选择流动相pH。缓冲范围应在其缓冲液离子pK值的+/-1pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围从pH3.8-5.8。甲酸盐的酸性较大，缓冲范围为pH2.8-4.8。对于碱性化合物而言，在高pH条件下才能得到其非离子化形态，但这对色谱柱不利。但许多碱性化合物在低pH条件下的保留就已经足够了。因此，虽然非离子化形态能得到更高的保留，但这对与所有的碱性化合物并不是实用和必要的。UV检测器常用的缓冲液：磷酸及其盐类具有良好的低UV透光率（＜200nm），和乙腈（190nm）一起，成为许多方法开发工作者的首选。对碱的分离，可以选择TEA（＜200nm）-磷酸盐。磷酸盐在有机相比例高的溶剂中溶解度较低，针对这一缺陷，建议磷酸盐缓冲液与有机溶剂混合时，有机相不要超过70%。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第15页,共75页，2024年2月25日，星期天优化反相色谱条件在确定了色谱柱规格、合适的固定相柱填料、流动相溶剂和改性剂后，即可开始优化方法。方法的优化是根据最终目标决定的。如果要开发质量控制方法，您可能会需要像等度分离这种可变因素较少的方法。如果目标是得到最高分离度，节省分析时间并不是首要问题，可以选择长柱使所有组分都得到最大分离度。如果分离速度很重要，则应使用短柱和高流速。对于含许多保留不同的目标化合物的复杂样品，用等度分离可能不能解决问题，应开发并优化梯度方法。等度优化的一般方法是不断改变流动相强度（%B），直到获得适当的保留范围。这种方法有时也称为“溶剂筛查”。对于简单的分离，k值应在1到10之间。如果k值太低（比如，<1），早洗脱的色谱峰可能不发生保留峰或融入基质组分，因此对其进行定量将非常困难而且不可重复。另外，低k值峰受柱外效应影响很大，可能会使峰展宽。如果k值太大（比如，>10），分析时间将变得过长，检测限会因峰展宽而提高。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第16页,共75页，2024年2月25日，星期天对于反相色谱中的等度方法开发是从流动相有机改性剂最高比例开始，然后逐渐降低。在降低流动相强度之前，先要确定所有组分都已从柱中洗出。如果组分保留在色谱柱中，以后可能在B相比例较低的流动相中洗脱，成为无法解释的“鬼峰”。通常，流动相以+/-10%（如，90%B、80%B、70%B等）或+/-20%的幅度改变。一旦建立优化条件，如果目标还没有得到完全分离，则需继续提高选择性(α)。如需分离两个相邻的色谱峰会涉及到许多实验参数的调节。温度可以作为一个变量。大多数现代仪器都具有某种类型的柱温控制器，大部分反相柱可以承受高达60℃的温度，有些甚至更高。一般来说，升高温度可以缩短所有峰的保留时间，但对有些峰的影响可能与对其它峰不同，从而导致选择性发生变化。其它用于改变选择性的变量如下：1.pH（对于可离子化的化合物）2.缓冲液（离子）强度3.缓冲液类型（比如，磷酸盐、醋酸盐或甲酸盐，取决于需要的pH范围）4.流动相有机改性剂（比如，从乙腈变为甲醇或两者的混合液）5.流速（一般而言，较低的流速可能对分离略有改善）6.离子对试剂浓度（如果使用离子对RPC）第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第17页,共75页，2024年2月25日，星期天如果调节这些参数还不能改善分离，那么最好的解决办法就是改变色谱柱或固定相。更长的色谱柱具有更多塔板数，因此有助于分离，但切记，分离度只能增加长度的平方根。柱长加倍使分析时间和溶剂消耗加倍，而灵敏度降低，但只能使分离度提高约40%。梯度优化对于含各种组分的样品混合物来说，选择单一流动相组分可能得不到满意的解决方案。例如，某些样品组分，如强极性分析物，可能很快从反相柱上被洗脱下来，而疏水性组分可能在疏水性的C8或C18上吸附非常强，洗脱不下来。对这一问题的解决方案是随时间改变流动相组成（梯度洗脱）。在绝大多数例子中，初始流动相非常弱（比如，含水量高），随时间的推移，有机溶剂的百分比通常是以线性形式增加。如使用了宽范围的快速梯度（比如，10分钟内B由5%变到95%），确定目标化合物的最佳梯度范围。找到目标峰洗脱的流动相比例，然后通过下一次梯度，调节k*范围，让梯度分离在合理的时间内完成。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第18页,共75页，2024年2月25日，星期天方法开发过程需满足条件：理论板数：一般要求＞3000或4000分离度：一般要求＞1.8，实际研究尽量＞2.0托尾因子：一般要求0.95~1.05之间待测物保留时间：最好调至20分钟左右（根据分离度）第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第19页,共75页，2024年2月25日，星期天2、供试品溶液制备：化药一般直接用水、相应的溶剂或流动相溶解即可；而中药一般过程相对复杂，现以中药的制备进行说明，包括以下过程。提取溶剂选择提取方式提取时间第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第20页,共75页，2024年2月25日，星期天提取溶剂选择一般选择80%甲醇、50%甲醇、乙醇等（注意100%强溶剂的色谱峰过早洗脱现象）；选择溶剂时，固定提取方式和提取时间（一般超声30分钟），看哪种溶剂提取含量高，证明效果好，为最佳提取溶剂。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第21页,共75页，2024年2月25日，星期天提取方式选择一般回流提取1小时、超声30分钟、冷浸8小时等（各条件需验证）；如：提取溶剂为80%甲醇，在以上三条件下确定最佳提取方式；经验：一般回流提取1小时与超声30分钟比较接近，由于超声比较方便，故一般选择超声提取（注意超声提取功率、频率、时间的选择）；有些较坚硬的样品，如三七、郁金、莪术粉等，一般选择回流提取；有些较难提取的样品可能需回流和超声提取配合使用；有些化学药品超声后含量会降低（破坏分子结构）；通常冷浸效果不好（现药典很少单独采用此法），有些样品需冷浸同超声或回流配合应用，以达到良好的提取效果；有些样品如母丁香等含易挥发的成分冷浸效果好，另外挥发油一般用冷浸。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第22页,共75页，2024年2月25日，星期天提取时间选择在确定提取溶剂及提取方式后，通过实验确定提取时间；如实验设定：分别提取20分钟、30分钟、40分钟甚至50分钟…，测定含量，通过含量多少确定最佳提取时间；下图：提取20分钟与30分钟样品含量无较大差异，为了确保提取完全，选择30分钟（需考虑天气、制粒等因素的差异，故选择30分钟）。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第23页,共75页，2024年2月25日，星期天提取容器选择一般选择用锥形瓶或容量瓶锥形瓶：样品不完全溶解于提取溶剂方法：取一定量样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入一定量提取溶剂，称定重量，超声（或回流）提取一定时间，取出，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。容量瓶：样品全部溶解于提取溶剂方法：取一定量样品，精密称定，置量瓶中，加入提取溶剂适量，超声（或回流）提取一定时间使样品溶解，放冷，用提取溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。注意：若不完全溶解于提取溶剂的样品采用容量瓶法，则检测结果可能会偏高。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第24页,共75页，2024年2月25日，星期天3、方法验证内容专属性检测限（LOD）与定量限（LOQ）：含量测定不用做此项，杂质定量需做此项；线性精密度：包括重复性试验及中间精密度试验，已有重现性不需再验证中间精密度；准确度范围耐用性含量测定第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第25页,共75页，2024年2月25日，星期天专属性专属性系指在其他成分（如：杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。通常，鉴别反应、杂质检查、含量测定均应考察其专属性。方法1：在杂质可获得的情况下，可向试样中加人杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果。方法2：在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过测定含有杂质或降解产物的试样，与另一个已验证的方法或药典方法比较结果。或对试样用强光照射、高温、高湿、酸（碱）水解或氧化的方法进行加速破坏，用两种方法进行含量测定，比较测定结果。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测进行峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第26页,共75页，2024年2月25日，星期天专属性中药复方可做阴性对照样品：阴性对照色谱图中，在与对照品相应位置无色谱峰，则无干扰。中药复方有阴性干扰是很常见的事，含测是只要阴性干扰不大于5％的话，是可以接受的。具体做法是：将那个“小包”也通过积分，计算其峰面积，再根据你样品和阴性样品的取样量分别计算该成分的含量，阴性中该成分含量应低于样品含量的5％；如果大于5％说明专属性不强，实在没办法以别的成分定量的话，就只能做双阴性了，但法规上有一些矛盾。色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明诸成分在图中的位置，色谱法的分离度应符合要求。代表性图谱包括：阴性对照色谱图、对照品色谱图、供试品DAD图、对照品DAD图、质谱图及各条件下的破坏性实验图谱等。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第27页,共75页，2024年2月25日，星期天检测限（LOD或DL

）：含量测定可不验证检测限系指试样中的被测物能够被检测出的最低量。药品的杂质测定，应通过测试确定方法的检测限。方法1：非仪器分析目视法用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。方法2:信噪比法用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较（现仪器一般不需做空白样品，可直接计算出信噪比），计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。数据要求：应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第28页,共75页，2024年2月25日，星期天定量限（LOQ或QL）：含量测定可不验证定量限系指试样中的被测物能够被定定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定方法的定量限。信噪比法：一般以信噪比为10:1时相应浓度或注人仪器的量确定定量限。数据要求：应附测试图谱，说明测试过程和定量限结果。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第29页,共75页，2024年2月25日，星期天线性线性系指在设计的测定范围内，检测结果与试样中被测物的浓度直接呈正比关系的程度。线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量测定和含量测定均需验证线性。验证方法应在规定的测定范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5个浓度的供试样品，每个浓度各一份，每份供试样品检测3次，以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第30页,共75页，2024年2月25日，星期天线性通常做法（1）如上：取不同浓度的标准品溶液（不少于5个浓度），分别进样相同体积，然后计算进样量与峰面积之间的线性关系；（2）取同一浓度的标准品溶液，分别进样不同体积（不少于5个体积），然后计算进样量与峰面积之间的线性关系。个人认为：第（2）种更科学，包括样品量的变化，进样体积的变化，但从药审角度来看，更青睐于第一法，因为第一法是单因子考察。一般情况：直线40%设为常量，最高量为常量的2.5倍，最低量为常的1/4倍，点数一般5~7个。如：分别精密量取标准品贮备液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，混匀…其中4ml配制的浓度为常量浓度第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第31页,共75页，2024年2月25日，星期天线性通常做法若为新药，常量浓度如何确定？可通过3根不同填料色谱柱，确定尖峰（非平头）最大浓度，同时需综合考虑样品制备过程。常量为最大浓度的40%最小量为确定常量的1/4进样量常量：20μl故一般体积进样：则为5μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl常量：10μl故一般体积进样：则为2.5μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第32页,共75页，2024年2月25日，星期天线性线性范围要足够宽，含量测测至少80%~120%，但药材有时特别低，所以药材要保证最低点在线性范围内。不同分析方法的线性验证和准确度验证需涵盖的最低浓度范围

第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第33页,共75页，2024年2月25日，星期天线性数据要求应列出回归方程、相关系数和线性图。可接受标准：r值在0.9995以上，Y轴截距应在100％响应值的2％以内。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第34页,共75页，2024年2月25日，星期天精密度精密度系指在规定的测试条件下，同一均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。精密度与准确度不同，下图形象地描绘了精密度和准确度之间的差别。精密度体现了多次重复测定同一被分析物时各测定值之间的接近程度，但它不能表达与已建立的真实值或参考值之间的符合程度，后者由准确度来测定。通过一系列的测定值，可以得到良好的精密度，但是由于所用分析方法存在的偏差，所得的平均值不一定与真实值或参考值相符，在这种状况下，需要修改方法以消除偏差。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第35页,共75页，2024年2月25日，星期天精密度精密度与准确度关系图第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第36页,共75页，2024年2月25日，星期天精密度验证方法精密度可从重复性、中间精密度、重现性三个层次考察。重复性：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。重复性需考察以下两方面：仪器精密度和方法精密度仪器精密度：考察仪器（包括进样器）、色谱柱、流动相、样品与色谱条件之间是否符合要求。考察方法：取同一标准品溶液，连续进样6针，测得峰面积或峰高，计算RSD%值。可接受标准：RSD%≤2.0n≥6第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第37页,共75页，2024年2月25日，星期天精密度方法精密度：在考察仪器精密度的基础上，考察所拟定的方法是否符合精密度要求，包括称量，制备及测定过程。考察方法：取同一样品，在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。例如：设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液或将相当于100%浓度水平的供试品溶液，用至少测定6次的结果进行评价。可接受标准：RSD%≤2.0n≥6第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第38页,共75页，2024年2月25日，星期天精密度中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员、用不同设备测定结果之间的精密度。验证方法：为考察随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。取同一批样品，采用同一根色谱柱，于不同日期、由不同分析人员、在不同设备上考察含量结果。可接受标准：RSD%≤2.0n≥4第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第39页,共75页，2024年2月25日，星期天精密度重现性：在不同实验室之间由不同分析人员测定结果之间的精密度。验证方法：法定标准采用的分析方法或在不同实验室之间进行方法转移时，应进行重现性试验。例如建立药典分析方法时，通过协同检验得出重现性结果。协同检验的目的、过程和重现性结果均应记载在起草说明中，应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果。可接受标准：RSD%≤2.0n≥4第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第40页,共75页，2024年2月25日，星期天准确度准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。一般用回收率表示。准确度应在规定的范围内测试。准确度是定量测定的必要条件，因此含量测定、杂质定量测定均需验证准确度。验证方法准确度应在规定的范围内建立，至少用9个测定结果进行评价。例如：测定含量的准确度，按标示量的80%，100%和120%配制三个浓度的溶液，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。根据测定结果与配制浓度计算出平均回收率以及相对标准偏差。原料药含量测定准确度验证方法：方法1：用已知纯度的对照品或供试品进行测定方法2：用本法所得结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第41页,共75页，2024年2月25日，星期天准确度制剂含量测定准确度验证方法：方法1:用含已知量被测物的各组分混合物进行测定方法2:如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加人已知量的被测物进行测定。（加样回收试验，一般用于中药）方法3:用本法所得结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较特别说明一下中药的加样回收试验：用已知纯度的对照品做加样回收测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。在加样回收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之各必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第42页,共75页，2024年2月25日，星期天准确度加样回收计算公式第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第43页,共75页，2024年2月25日，星期天准确度数据要求：在规定的范围内，取同一浓度（100%）的供试品，用6个测定结果进行评价；或设计3个不同浓度（80%、100%、120%），每个浓度分别制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在1∶1左右。应报告供试品的取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（%）计算值，以及回收率（%）的相对标准偏差或可信限。可接受标准：回收率（%）平均值在98.0%~102.0%之间RSD%≤2.0n≥9（或n≥6）浓度与回收率关系-美国官方分析化学师协会（AOAC）.gif第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第44页,共75页，2024年2月25日，星期天范围范围系指能够达到一定的精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于被限定含量的区间。可接受标准：至少标示量（100%溶液）的80%~120%不需另做测试，写出结论。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第45页,共75页，2024年2月25日，星期天耐用性耐用性系指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法可用于常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。如果通过耐用性研究发现分析方法对某个或某些测试条件敏感或要求苛刻，则建议在方法中予以写明。方法耐用性影响因素：典型影响耐用性的变动因素：1、被测溶液的稳定性；2、样品的提取次数、时间等（前面已讲过）；液相色谱法（HPLC)中的典型影响耐用性的变动因素：1、流动相的组成；2、流动相的pH值；3、不同品牌或不同批号的同类型色谱柱；4、柱温；5、流速；6、其他第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第46页,共75页，2024年2月25日，星期天耐用性HPLC含量方法耐用性考虑因素及变化范围示例：流动相的组成：有机相的±5%，例如方法规定流动相缓冲溶液与甲醇的比例为45∶55,那么允许使用40∶60至50∶50范围的比例；流动相的pH值：±0.5,如果巳知pH值为关键影响因素，变化范围会更小（±0.2）；色谱柱：3种不同填料的色谱柱柱温：±5℃检测波长：±5nm流速：±20%一般对照及样品各一个，每个进2针；可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据的相对标准差应不大于2.0%。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第47页,共75页，2024年2月25日，星期天耐用性溶液稳定性研究：溶液的稳定性研究用来证明根据相应方法制备的样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。如果方法中没有规定有效期，样品溶液和标准品溶液需进行稳定性研究。样品溶液和标准品溶液依据方法进行配制和分析。在室温或其他条件下（如冰箱2〜8℃)储存适当的时间。每个间隔点，用新鲜配制的标准品溶液做对照，测定储存的样品溶液和标准品溶液。测定结果与初始结果进行比较，符合接受标准便可确认样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在规定储存时间是稳定的。方法：标准品溶液稳定性考察：如上过程即可第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第48页,共75页，2024年2月25日，星期天耐用性样品溶液稳定性考察：取供试品溶液，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、18h、24h进样测定峰面积或峰高，计算RSD%值，要求RSD%≤2.0；注意事项：样品溶液稳定性考察时间要足够长，如测定三七总皂苷进样一针约需1.5小时，若溶液稳定性考察8小时，则配制的样品第7针数据即为无效数据。有些样品，如在4小时内峰面积发生较大变化，则样品需在避光或低温下测定（需考察）；若在避光或低温下8小时至少4小时稳定，则需在拟定的标准项下注明条件；若在避光或低温下4小时内仍不稳定，则需在拟定的标准项下注明配制后立即测定或临用新制。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第49页,共75页，2024年2月25日，星期天含量测定及限度的制定含量测定要求：（l）应首选处方中的君药（主药）、贵重药、毒性药制订含量测定项目。如有困难时则可选处方中其他药味的已知成份或具备能反映内在质量的指标成分建立含量测定。如因成品测定干扰较大并确证干扰无法排除而难以测定的，可测定与其化学结构母核相似，分子量相近，总类成份的含量或暂将浸出物测定作为质量控制项目，但必须具有针对性和控制质量的意义。

（2）含量测定方法可参考有关质量标准或有关文献，也可自行研究后建立，但均应作方法学考察试验。

（3）含量限（幅）度指标，应根据实测数据（临床用样品至少有三批、6个数据，申报生产用样品至少有10批、20个数据）制订。含量限度一般规定低限，或按照其标示量制订含量测定用的百分限（幅）度。毒性成分的含量必须规定幅度。

（4）含量限度低于万分之一者，应增加另一个含量测定指标或浸出物测定。

（5）在建立化学成分的含量测定有困难时，可考虑建立生物测定等其它方法。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第50页,共75页，2024年2月25日，星期天含量测定及限度的制定限度的制定：各批次样品检测数据比较接近，则取其平均值下调15%；各批次样品检测数据相差较大，则取80%的数据为低限；80%的数据为20个数据中，最后4个较低数据不要，倒数第5个数据为限度（该方法一般用于药村或稳定性不好的制剂。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证第51页,共75页，2024年2月25日，星期天含量测定及限度的制定另外说明：做标准时药材检测及样品含量限度的复核：投料药材均需留样检测，10批样品需有10批药材数据，药材检测后计算转移率。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法验证原则：原药材直接粉碎投料的制剂：转移率应大于80%；（制剂10%、检验10%损失）原药材经一步提取的制剂：转移率应大于60%~70%；原药材经多步提取的制剂：转移率应大于50%~60%；如复方丹参片中丹参酮ⅡA的转移率为22%也允许。第52页,共75页，2024年2月25日，星期天方法确认适用范围适用于：物料和产品中不需要进行验证的检验方法以及药典方法和其他已验证的法定标准。通过方法确认来证明方法在本实验室条件下的适用性。不适用于：实验室日常测试操作步骤不需要进行方法确认，例如（包括但不限于）干燥失重、炽灼残渣、各种湿法化学步骤如酸值和简单的仪器方法如pH计，除非有特殊要求。确认方式通常采用以下两种方式：方式一：由两名检验人员分别独立对同一批产品进行检验（如可能，使用不同的仪器），比较两人的检测结果来证明方法在本实验室（人员、分析仪器、试剂等）的适用性。方式二：根据验证目的和评估结果选择相关项目进行确认，如下表：第一部分：药品质量标准分析方法验证方法确认第53页,共75页，2024年2月25日，星期天检验项目确认内容示例（仅供参考）第一部分：药品质量标准分析方法验证方法确认第54页,共75页，2024年2月25日，星期天方法转移是在两个实验室之间进行，通过比较转出方和接受方两实验室的分析结果，以确认分析方法在接受方实验室条件下的适用性。方法转移方案为保证方法转移的顺利实施，在双方充分沟通的基础上，确定方法转移方案。方法转移方案应对以下内容作出明确规定，并经双方审核、批准。方法转移的目的；待转移的检验方法；物料：试验样品（包括：批号、剂量、产品号、储存条件）和标准品（批号、储存条件、含量及有效期等）；试验样品应为同批有代表性的样品，标准品最好为同来源同批次。样品和标准品在运输过程中要符合其规定的储存条件；接受标准；异常数据的调查；实验结果的评估；双方的职责。第一部分：药品质量标准分析方法验证方法转移第55页,共75页，2024年2月25日，星期天方法转移的批次数（仅供参考）：辅料、中间产物、包材、原料和成品（鉴别实验和其它简单实验）：1批原料和成品（除鉴别实验和其它简单实验）：2批（条件允许3批）方案的实施：双方均应在规定的时间内完成样品的检验，以减少因检验双方实验间隔时间过长带来的差异。方法转移报告：工作完成后，应按规定的模板出具报告，并经双方审核和批准。报告中必须明确的写出结果和结论，包括评价和建议。方法验证、方法确认和方法转移的文件管理内容：略第一部分：药品质量标准分析方法验证方法转移第56页,共75页，2024年2月25日，星期天1、新的或是未做的药品标准第一次操作时的注意事项：先查一下方法学研究材料或文献资料等，了解一下操作的具体细节。经验：液相色谱法等度操作，先长柱后根据情况采用短柱、高效柱或对色谱条件做以适当的调整以达到系统适用性实验条件；梯度操作，方法未指明则用长柱且需采用不同填料的长柱进行测试（即使第一根柱符合条件）。有关物质或限度检查需注意检测器采样频率的合理设置，过大会造成峰丢失现象或准确性的问题，过小会造成基线噪声的增大。容量法要搞清楚原理，关键操作点，如与时间相关则需注意操作顺序及反应时间，特别是在生化药方面尤其重要；要养成先加样、先反应、先检测的习惯。2、注意方法的正确性：不管是药品质量标准还是药典标准都是人制定的，在方法设计时都可能有考虑不到或疏忽的地方，所以我们按标准操作时也要仔细研究标准的正确性，及早发现问题并对标准做以修订、提高。如：血塞通及三七总皂苷原标准与现行标准的问题。如：药典中刺五加药材标准中进样量的问题：100%强溶剂造成色谱峰过早洗脱，导致峰变形；解决办法：减少进样量或降低溶剂强度。舒血宁注射液银杏内酯含量检测问题：溶剂与流动相极性差异太大。第二部分：检验基础知识第57页,共75页，2024年2月25日，星期天3、容量器具的校准、使用问题：常用的量瓶、胖肚移液管、刻度吸管、滴定管等均需校准，因为现市场假货太多，质量参差不齐，有的误差极大，即使是真货也要做校正，以减少误差的来源。另外标准规定精密量取最好用胖肚移液管，尽量不要用刻度吸管，因为允差不一样，胖肚移液管的允差会更小。注意量瓶及移液管的正确使用。容量瓶的正确使用方法和步骤.doc移液管的正确使用方法和步骤.doc4、液相样品针筒式滤器使用：采用不同材质的针筒滤器需验证是否有较大的吸附性，如最常用的尼龙膜N66可耐受大多数有机溶剂和碱性溶液，但是对Pr具有较大的吸附性，若要滤Pr类样品可用混合纤维素膜(MCE)；醋酸纤维素和再生纤维素滤膜对多环芳烃具有较低的吸附性；一般来说滤膜对多环芳烃的回收率能达到80%左右就不错了，所以在有条件的情况下我们应当针对不同样品做一下回收率，以验证滤膜是否适合该样品；平时使用时需弃去初滤液取续滤液进样分析；若吸附性较大需采用其它方法处理（如离心等）。第二部分：检验基础知识第58页,共75页，2024年2月25日，星期天5、对照品浓度与样品浓度应相匹配：含量测定采用单点外标法时，对照品的浓度与供试品溶液的浓度要接近，这样才能保证结果的准确性，因为直线方程可能不过原点，有一定的截距，另外样品浓度可能会超出或低于线性范围，这样就会造成较大的误差。含量测定采用外标两点法或外标多点校正曲线法时，供试品溶液浓度要落入曲线内，另外，若使用ELSD、CAD等这些非线性响应的检测器，数据需进行拟合，一定要使拟合后的供试品落入到对照品的两点内。6、水与甲醇、乙腈、DMA、DMF等有机溶剂混合问题：在配制混合流动相或是供试品溶液制备定容过程中，我们会发现水与MeOH、ACN、DMA、DMF等有机溶剂混合会发生明显的放热或吸热过程，从而导致体积会发生变化，原因是由于水分子氢键破坏或重新形成而导致产生熵变的过程。水与MeOH、DMA、DMF混合会放出大量的热，而与ACN会吸收热量。所以我们配制流动相或样品时要多加注意，流动相分别量取一定体积配制，配后要放冷至室温使用；供试品溶液先加入适量有机溶剂，待冷至室温时再定容。如：舒血宁总黄酮醇苷含量测定。第二部分：检验基础知识第59页,共75页，2024年2月25日，星期天7、血注或三七总皂苷含量测定：目标成分洗脱出后不宜立即用100%乙腈清洗强保留组份，要用梯度的方法升到90%清洗，以避免强保留成分在高浓度乙腈中析出，造成堵塞仪器管路或破坏色谱柱。8、基线漂移的理解：HPLC：色谱柱未平衡好、柱温未稳定、流动相变化等，梯度洗脱正常；GC：程序升温，柱流失增加引起。9、顶空法测定乙醇残留问题：注意管路系统的吸附性，造成重复性差，需经常热清洗。10、分光光度法测定血塞通总皂苷的注意事项：由于皂苷显色反应产生的颜色受溶液浓度、反应温度、反应时间等因素的影响，所以须注意反应条件的控制。精密加入5%的香草醛-冰乙酸溶液及高氯酸溶液要迅速；保温结束后，要快速加入5ml冰乙酸（也可加一个测一个）；测量吸收度要快，尽量在10分钟内结束。该反应液会随时间出现吸收值下降的现象：20min下降0.25第二部分：检验基础知识第60页,共75页，2024年2月25日，星期天11、天平称量问题：简单的操作流程及注意事项一、称量前的电子天平操作

1、用前关门、关闭空调；

2、调整天平的水平；

3、天平的放置不要放在下列位置：阳光直晒、潮湿、不平稳的地方

二、称量时电子天平的操作

1、称量容器的选择：（1）避免使用过大的容器称重，以免浮力导致误差；

（2）避免使用塑料及磁性物质作容器，以免静电引力及电磁感应导致误差；

（3）如药品吸水易潮(如：NaOH)，不可用称药纸称重可用小烧杯承装；

2、称重时的注意事项

（1）采用与称量精确度相适应的天平。（2）称重时需将待测物及其承装容器与电子天平维持在相同的温度，不要称量直接从烘箱或冷藏箱内拿出的样品

；特别是称量对照品：如第二天称量，今天就把量瓶放到天平室，使量瓶的温度与湿度条件与天平室保持一致。

第二部分：检验基础知识第61页,共75页，2024年2月25日，星期天（3）称重时装有待测物的承装容器，不要用手直接拿，以免手上的汗，油及

其它微小之杂物，影响称重值；可采用戴手套，或用夹子及纸条代替。

（4）称重时要将装有待测物的承装容器放置在称盘中间，避免造成误差。

（5）精称时最好先用一般电子天平粗称，再移至精密天平精称，以避免超重对天平的影响。（6）精称时，需将精密天平的门关闭，避免风的影响。（7）精称时，不可靠、按在放精密天平的实验台上，避免振动天平造成误差。（8）称量对照品或较少量样品时，最好称前校正一下天平（内校）；不要将对照品称量到称量纸上再往量瓶内转移，应当直接称至量瓶内。（9）注意所称样品是否易受静电影响，有静电则消除。当空气湿度低于30%至40%时，避免使用由塑料材质的称量容器。这样的环境会增加静电电荷引起的风险。三、称重完毕的电子天平的维护

1

需用干的布将称重盘擦干净（关闭时）。

2

用软毛刷将天平及天平周围刷干净。

3

定期校正天平。

第二部分：检验基础知识第62页,共75页，2024年2月25日，星期天天平最小称样量问题：我国药典规定：“精密称定”系指称取重量应准确至所取重量的千分之一；用十万分之一（可读0.01mg）的天平称取10mg样品，可不可以保证药典规定的千分之一？如何保证？需了解天平最小称样量的概念！如何确定天平的最小称样量呢？公式：第二部分：检验基础知识最小称样量（mg）扩展因子（K）：100次称量结果中选定允许误差范围内的称量次数168.27%295.54%399.73%相对误差:0.1%重复性误差（SD）：最小称量值的标准砝码放在天平上，称量十次，计算十次读数的标准偏差（mg）第63页,共75页，2024年2月25日，星期天天平最小称样量问题：第二部分：检验基础知识第64页,共75页，2024年2月25日，星期天天平最小称样量问题：USPweightsandbalances.pdf电子天平准确称量最小值的确认.doc12、黄芩苷含量测定问题：黄芩苷对照品在甲醇中溶解性不好，故制定方法时浓度最好不要超过0.1mg/ml，有的药品标准对照品浓度是0.2mg/ml，放置后较易析出，故最好临用新制。新配黄芩苷对照品时可60℃超声至完全溶解，对于这类较难溶解的对照品溶液制备最好制备双标，以验证称量与溶解情况是否符合要求。同样对于黄芩苷或黄芩提取物制备供试品溶液时也要超声至完全溶解。13、舒血宁总黄酮醇苷含量测定问题：与黄芩苷对照品一样，槲皮素、山萘素、异鼠李素也都不易溶解，故也需超声至完全溶解，并制备双标考察溶解情况。另外供试品溶液制备注意甲醇与水溶解的发热、体积变化问题。14、三七总皂苷大孔树脂残留物检查问题：对照品溶液与供试品溶液中所含DMA浓度不同(对28%/供25%)，这一点很关键，影响结果的准确性，故我们以后制定质量标准时一定要注意避免这样的问题出现。沸点166℃

三七总皂苷大孔树脂残留物检查.doc第二部分：检验基础知识第65页,共75页，2024年2月25日，星期天15、低浓度样品、有关物质检查、溶剂残留或农药残留检查问题：注意HPLC或GC的检测器关键参数的设置：HPLC：峰宽（响应时间）GC：数据采集速率/最小峰宽设置过大可能造成色谱身变形失真，理论板数降低，影响分离度，影响分析结果的可靠性和准确性，也可能出现测不到峰或丢失峰的情况；设置过小将导致基线噪音增大，影响到信噪比，同时形成的文件也较大，占用贮存空间。一般情况下，液相0.5~1.0S较合适，气相可能会更低，几毫秒或几十毫秒；要针对具体情况选择适当的值。16、HPLC样品瓶使用问题：样品瓶装入样品量不要太多，但也不要太少，太多吸样时会造成负压情况，从而可能会造成吸样量不准确；太少，在夏季或样品量较大时溶剂可能挥发造成浓度的变化；1/2至2/3较合适；同时镙纹盖也不要拧的太紧，也是避免负压情况。第二部分：检验基础知识第66页,共75页，2024年2月25日，星期天17、新色谱柱用前应当做测试：作为仪器分析实验工作者，应具有良好的实验记录习惯，尤其应记录色谱柱的状态，经常性进行柱效测试，对色谱柱效能有充分的了解。使用一个新色谱柱之前，应在流动相组成不变的情况下进行性能测试实验，并将性能报告存档。记录理论塔板数、色谱柱长度及内径记录测试样品的名称及K’值记录所用固定相和流动相记录流动相的流速记录测试样品的进样量记录实验的温度条件记录色谱峰的对称性记录测试时色谱柱的压力第二部分：检验基础知识第67页,共75页，2024年2月25日，星期天18、实验器具清洁：一定要清洁干净，以避免实验误差的引入！这些误差我们完全可以避免！对于体积计量器具，它所量取的体积准确与否不仅仅与这个器具是否是一个经过校准的、合格的体积计量器具，也决定于这个器具是否正确使用，用的是否是一根清洁“干净”器具！因为：量取的体积与液体分子同玻璃仪器的器壁之间的吸引力（附着力）有极大的关系，一根洁净的与一根表面有残留物的器具液体分子与器壁的附着力是不同的，所以所量取的体积也是不一样的；想想放液后挂水珠和不挂水珠的器具所量取的体积能一样吗？所以体积计量器具的清洁很重要！移液管、容量瓶等：不好涮，可用相应的洗液浸泡，清洗！第二部分：检验基础知识第68页,共75页，2024年2月25日，星期天18、流动相的寿命和降解的影响：水：很关键！水质及微生物的影响水是稳定的溶剂，但在存贮时可被容器或微生物所污染，需定期更换符合要求的新水，另外，需使用清洁的棕色瓶，避免微生物的生长。四氢呋喃：光、热和氧气可使产生自由基从而发生过氧化反应。过氧化物与被分析物或柱填充物间可能发生相互作用。较高紫外吸收是四氢呋喃中含过氧化物导致的问题之一。开瓶后尽快用。第二部分：检验基础知识第69页,共75页，2024年2月25日，星期天1、正常刻度移液管在截取体积时的放液速度，粘度大小对其是否有影响？“精密量取”建议使用胖肚移液管，尽量不要用分度吸管截取；另外放液速度会影响量出的体积，因为不同规格的移液管水的流出时间是有要求的；截取体积