云岭牛 第5部分：体外胚胎生产

1DB53/T447.5—2022云岭牛第5部分：体外胚胎生产本文件规定了云岭牛供体的选择与饲养管理、卵母细胞的获取、卵母细胞的检出与分级、卵母细胞的IVM、卵母细胞的IVF、受精卵的IVC等技术要求。本文件适用于牛体外胚胎生产和移植技术操作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB53/T447云岭牛第4部分：胚胎移植3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1活体采卵ovumpickup借助超声波探测器或内窥镜，直接从供体牛活体卵巢中采集（吸取）未成熟的卵母细胞。3.2体外受精invitrofertilization在体外培养条件下完成卵母细胞的成熟、受精、以及受精卵发育成可移植胚胎。其过程包括卵母细胞的体外成熟（Invitromaturation，IVM）、体外受精（Invitrofertilization，IVF）和受精卵的体外发育培养（Invitroculture，IVC）。3.3体外胚胎生产invitroembryoproduction以IVM、IVF和IVC连续步骤生产胚胎的过程，称为体外胚胎生产（Invitroembryoproduction，IVP）。4设施、仪器及器具、耗材4.1主要设施胚胎工程实验室、采卵室、分牛栏、保定架等。4.2主要仪器超净工作台、超纯水仪、高压灭菌仪、干热灭菌仪、EO灭菌仪、超低温冰箱、电冰箱、电子天平、倒置显微镜、实体显微镜、CO2培养箱、活体采卵装置、胚胎冷冻仪、恒温台、水浴锅、细胞(胚胎)培养运输仪、液氮罐、pH测定仪、封口机等。4.3主要器具、耗材2DB53/T447.5—2022硅化瓶、烧杯、量筒、过滤灭菌滤器（0.22µum，0.45µm）、酒精灯、离心管（10mL或15mL、50mL）、培养皿、注射器（1mL、5mL、10mL、20mL、50mL）、检卵器或微细玻璃管、巴氏玻璃管、记号笔、计时器；过滤式集卵（胚）杯、手术器具一套（毛剪、止血钳、镊子等）、塑料细管专用剪、塑料细管（0.25mL）、胚胎解冻杯和温度计、胚胎移植枪、移植枪加外套和保护膜、75%酒精棉球等。5供体牛的选择与饲养管理供体牛的选择参照DB53/T447.4的规定执行。供体牛的饲养管理参照DB53/T447.4的规定执行。6卵母细胞的获取6.1获取方式从活体供体牛卵巢中采集（活体采卵）或从屠宰后母牛离体卵巢中采集卵母细胞。6.2活体采卵（OPU）6.2.1采卵前的准备6.2.1.1装置和器具B型超声波扫描仪、扇形阴道探头（7.5MHz）、真空泵和恒温器；16G、17G、18G金属采卵针、回收管、50mL离心管（集收杯）、一次性注射器（5mL、10mL）等。6.2.1.2麻醉剂2%利多卡因或普鲁卡因。6.2.1.3采卵液D-PBS+10IU/mL肝素钠+1%FCS+青霉素100IU/mL+100μg/mL链霉素。6.2.1.4采卵装置的调试将采卵装置按要求安装好，并调试到正常工作状态，同时把采卵液及其它必需物品在专用台车或工作台上摆放好。6.2.1.5供体牛的保定与麻醉按DB53/T447.4的规定执行。6.2.2采卵按以下步骤采卵：a)用右手将B超探头轻缓地插入母牛阴道子宫颈一侧的穹隆处，并把握好；b)左手插入直肠，用手隔着直肠壁找到卵巢，并将其贴近探头面上，通过B超显示屏观察卵巢是否正常，记录卵泡的数目及其大小；c)将吸满采卵液的单腔采卵针插入装在探头上的采卵针筒中；d)用直肠中的左手移动卵巢使穿刺目标卵泡位于B超显示屏中显示的采卵线上，根据B超显示屏上所显示的目标卵泡位置，用把握探头的右手手指推动进针管进行穿刺（针头刺穿阴道壁3DB53/T447.5—2022和卵泡壁）的同时踩下脚踏开关将卵母细胞及卵泡液一同吸到置于恒温器中收集管内（37。C恒温）；e)穿刺目标卵泡为直径2mm～8mm；f)吸卵时真空泵压力80mmHg～85mmHg。6.2.3采卵频率根据实际需要可采用每周1次～2次、每月一次或在母牛集中配种前随机选择，批量采卵。6.3从屠宰后母牛离体卵巢中采集卵母细胞6.3.1主要材料保温箱（壶）、止血钳、手术剪、乳胶手套、注射器、针头、离心管、注射器用灭菌过滤器（0.25μm）等。6.3.2卵巢保存液灭菌的PBS液或生理盐水+100mg硫酸卡那霉素。6.3.3卵巢的收集母牛屠宰后30min内采集卵巢，用卵巢保存液冲洗2次～3次后放入盛有33。C保存液的保温瓶内保存，尽快带回实验室。6.3.4卵母细胞的吸取按以下步骤进行卵母细胞的吸取：a)以PBS液100mL+青霉素100万单位、链霉素10mg，过滤灭菌配置采卵液，装瓶后放入33。C的恒温槽内待用；b)清理卵巢上粘着的脂肪等组织，用保存液冲洗2次～3次，放入加有卵母细胞清洗液（含量0.3%BSA的BO液（见9.1.1）的烧杯后暂置入33。C恒温槽内；c)用带18G或20G针头的10mL注射器吸取2mm～8mm卵泡的卵泡液，注入到15mL或50mL离心管内置于恒温槽待检卵和分类。7卵母细胞的检出与分级7.1卵母细胞的检出按以下步骤检出卵母细胞：a)收集到的卵泡液倒入胚胎滤杯中，用含5%～10%CS或FCS的PBS液的洗卵液稀释，洗涤3次~4次，将滤杯中的液体及沉淀物倒入培养皿中；b)在实体显微镜下检出卵母细胞，如使用带有侧滤网的胚胎滤杯，则可直接在其中检卵；c)收集卵质色泽基本均匀、卵母细胞周围有1层～数层卵丘的卵丘-卵母细胞复合体（Cumulusoocytecomplexes,COCs）放入盛有PBS液的培养皿中。7.2卵母细胞的分级与选用7.2.1卵母细胞质色泽均匀，卵母细胞周围包围≥4层卵丘细胞，卵丘-卵母细胞复合体（Thecumulusoocytescomplexes，COCs）完整为Ⅰ级。4DB53/T447.5—20227.2.2卵母细胞质色泽均匀、卵母细胞周围包围3层卵丘细胞，COCs完整为Ⅱ级。7.2.3卵母细胞质色泽基本均匀、卵母细胞周围包围1～2层卵丘细胞，COCs基本完整为Ⅲ级。7.2.4卵母细胞质色泽基本均匀，卵丘细胞扩散或半裸、裸卵和闭锁卵为Ⅳ级。7.2.5选择Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级卵母细胞用于体外成熟培养。8卵母细胞的体外成熟培养（IVM）8.1体外成熟培养液的配制TCM-199（19mL）+CS或FCS1mL+FSH20μl（0.1μg/mL）或E21μg/mL+抗菌素20μl（青霉素10万IU/mL、链霉素100mg/mL），过滤灭菌后备用。8.2COCs的清洗与体外成熟培养（IVM）按以下步骤进行COCs的清洗与体外成熟培养（IVM）：a)用IVM培养液在35mm培养皿中制成100μl微滴3个～4个或放入4孔培养皿中，覆盖石蜡油，在CO2培养箱中平衡20min；b)COCs用IVM液洗涤3次，移入经平衡的培养微滴中（每滴15枚～20枚），在5%CO2、95%空气、38.5。C、饱和湿度的培养箱中培养22h。9卵母细胞的体外受精（IVF）9.1精子的制备与获能处理9.1.1BO液的配制（修正）9.1.1.1BO液的配制（修正）应由A液和B液组成。9.1.1.2A液：NaCl4.3092g+KCl0.1974g+CaCl20.2171g+NaH2PO40.0840g+MgCl20.0697g+0.5%酚红0.1mL+超纯净水500mL。9.1.1.3B液：NaHCO32.5873g+0.5%酚红0.04mL+超纯净水200mL，溶解后CO2气体通气30min作气相平衡。9.1.1.4A液76mL+B液24mL+丙酮酸钠0.1375g+抗菌素100μl（青霉素10万IU/mL，链霉素100mg/mL）+肝素钠130μl，过滤灭菌后冷藏保存。9.1.2精子清洗液配制BO液50mL+咖啡因10mmol/L，过滤灭菌。9.1.3精子稀释液配制BO液10mL+BSA（牛血清白蛋白）0.06g，过滤灭菌。9.1.4精子制备与获能按以下步骤进行精子制备与获能：离心5min；b)吸弃上清液，留1mL～2mL，同法第二次离心洗涤，留1mL，加1mL精子稀释液，使稀释后的精子数达(5106)个/mL；5DB53/T447.5—2022c)取95μl精子稀释液注入到5μl卵母细胞清洗液微滴中，使之成为100μl的精子培养微滴，覆盖石蜡油；d)在5%CO2、95%空气、38.5。C、饱和湿度的培养箱内预培养1h～1.5h。9.2卵母细胞的体外受精（IVF）IVM22h的COCs用卵母细胞清洗液洗涤3次，放入已准备好的100μl精子培养液微滴中（每滴15枚~20枚），在5%CO2、95%空气、38.5。C、饱和湿度的培养箱内受精5h。10受精卵的体外发育培养（IVC）10.1IVC培养液（m-CR1aa）的配制NaCl0.67g+KCl0.023g+NaHCO30.22g+半乳酸钙0.055g+丙酮酸钠0.004g+谷氨酰胺0.015g+酚红0.0005g+必需氨基酸1mL+非必需氨基酸1mL+超纯净水100mL+抗菌素100μl（青霉素10万IU/mL，链霉素100mg/mL），过滤灭菌，分装待用。10.2受精卵的清洗和体外发育培养按以下步骤进行受精卵的清洗和体外发育培养：a)取m-CR1aa培养液放入35mm培养皿或4孔培养皿中，覆盖石蜡油在培养箱中平衡1h；b)受精后的卵母细胞用5%CS的m-CR1aa培养液清洗3次；c)不作裸化处理，保留1层～2层卵丘细胞，移到预先盛有m-CR1aa培养液的100