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HPLC色谱条件的优化

与色谱技术进展

2021/7/131HPLC色谱条件的优化

与色谱技术进展2021/7/131一、分离度方程式

动力学热力学Rs=1/4N·K/(K＋1)·(α－1)/α

柱效保留时间选择性2021/7/132一、分离度方程式2021/7/132

混合物中不同组分在两相间平衡分配性质的差异是色谱分离的基础，研究物质平衡分配的内容属于色谱热力学的范畴。

容量因子K决定了组分的保留时间，而分离因子α决定了组分的分离选择性。这二个重要的色谱参数都取决于溶质、固定相和流动相的热力学性质。在溶质、固定相和流动相的某种组合下，只要不同组分的平衡分配性质存在差异，而且这种差异又足够大时，就有可能实现分离。2021/7/133混合物中不同组分在两相间平衡分配性质的2021/7要使分离的可能性变为可行，则必须设法控制色谱过程中使色谱峰发生展宽的各种外在因素。色谱峰的展宽主要决定于柱填料的性质以及填装质量，例如填料颗粒大小、粒径分布、形状、表面积、孔径、孔体积，等等。研究柱效与各种影响因素的关系是色谱动力学的内容。2021/7/1342021/7/1341、Rs分离度a）Rs=2（tR2-tR1）/（W2+W1）或1.18（tR2-tR1）/（W2,h/2+W1,h/2）b）Rs＜0.8不符合分析化学要求Rs=1二峰重叠2%Rs＞1.2二峰完全分离2021/7/1351、Rs分离度2021/7/1352、K容量因子a）K=（tR-tO）/tob）K对分离度的影响Rsαk/（K+1）2021/7/1362、K容量因子2021/7/136

2021/7/1372021/7/137

一般K取2-10，以2-4最好。c）改变K的方法改变流动相的溶剂强度（常以溶剂的溶解度参数或极性参数表示）。2021/7/138一般K取2-10，以2-4最好。2021/7/138

常用溶剂的溶解度参数δ（25℃）

溶剂δ溶剂δ正己烷7.3二氧六环9.8乙醚7.4丙醇10.2三乙胺7.5乙醇11.2环己烷8.2二甲基甲酰胺11.5醋酸乙酯8.6乙腈11.8三氯甲烷9.1醋酸12.4四氢呋喃9.1甲醇12.9苯9.2甲酰胺17.9二氯甲烷9.6水212021/7/139

常用溶剂的溶解度参数δ（25℃）

溶剂δ溶剂δ正己

对于大多数溶剂，极性参数（p）与溶解度参数（δ）基本呈平行关系。混合溶剂的溶剂强度按体积比取加权平均值。溶剂强度2个单位的变化一般可引起容量因子10倍的变化。2021/7/1310对于大多数溶剂，极性参数（p）与溶解2021/7/3、N理论塔板数a）N=16（tR/W）2或5.54（tR/Wh/2）2b）N对分离度的影响RsαNc）提高柱效的方法

●

增加柱长

●

改进柱填料（纯度、物理性状）

●

提高填装质量2021/7/13113、N理论塔板数2021/7/13114、α分离因子a）α=K2/K1=t＇R2/t＇R1b）α对分离度的影响Rsα（α-1）/α影响敏感，α的微小变化可显著改变Rsc）改变α的方法在保持流动相极性基本不变的前提下，适当改变流动相的组成、组分的比例或添加调节剂。2021/7/13124、α分离因子2021/7/13122021/7/13132021/7/13135、N与α对Rs贡献的比较2021/7/13145、N与α对Rs贡献的比较2021/7/1314二、VanDeemtor方程h=A·F1/3+B/F+Cm·F+Cs·F=A·F1/3+C·F式中h=1/N理论塔板高度F=流动相流速Cm，Cs=溶质在流动相和固定相中的浓度B=纵向扩散的贡献因子（纵向浓度梯度）A=涡流扩散的贡献因子（色谱柱的不均匀性）溶质在液体中的扩散系数比气体中小4—5个数量级，所以在HPLC中在通常的流速条件下B项的贡献可忽略不计。2021/7/1315二、VanDeemtor方程h=A·F1/3+B/F+1、柱效与流速的关系存在最佳流速2021/7/13161、柱效与流速的关系2021/7/13162、柱效与填料粒径的关系2021/7/13172、柱效与填料粒径的关系2021/7/13172021/7/13182021/7/1318a）A=2λ·dp式中2λ为与填充均匀性有关的因数dp为填料的粒径b）小的dp有利于传质c）减小填料粒径可显著提高柱效2021/7/1319a）A=2λ·dp2021/7/13192021/7/13202021/7/13202021/7/13212021/7/1321

由上表可见，减小dp可显著提高柱效→缩短 恒压色谱柱→增加流速↓↓缩短洗脱时间2021/7/13222021/7/1322三、影响分离效果的其他因素1、温度柱温提高到40℃以上，谓之HTLC（40℃—200℃）●温度上升→流动相粘度下降→流速增加（≤8ml/min）→容量因子K下降→保留时间缩短2021/7/1323三、影响分离效果的其他因素1、温度柱温提高到40℃以2021/7/13242021/7/1324●粘度降低→柱压下降→可采用细粒径填料（＜3um）或长色谱柱→提高柱效●提高灵敏度色谱峰高与柱温呈指数函数关系，即峰高的对数与柱温呈线性关系

峰高随柱温呈指数增加时，灵敏度也呈指数增加，数据表明，柱温从30℃上升至90℃，定量限约可降低10倍。2021/7/1325●粘度降低→柱压下降→可采用细粒径填料2021/7/13252021/7/13262021/7/1326●改善选择性不同溶质的保留时间随柱温变化的程度不尽相同，有可能使原来未分离的成分的得到基线分离，甚至发生洗脱顺序逆转。这种温度使选择性改变的特性在混合物的分离中非常有用，因为它只需简单地改变柱温，而无需改变其他色谱条件。2021/7/1327●改善选择性不同溶质的保留时间随柱温变化的程度不尽相2021/7/13282021/7/13282021/7/13292021/7/1329●温度匹配流动相须预热至柱温，温度匹配可以使柱效提高50%以上。柱后应配冷却单元，使洗脱液温度快速降到一固定值（如35℃），以避免检测信号的波动。2021/7/1330●温度匹配流动相须预热至柱温，温度匹2021/2021/7/13312021/7/13312021/7/13322021/7/1332●色谱柱以硅胶为基质的填料，其使用温度一般不超过60℃；HTLC使用以氧化锆、多孔石墨碳、高分子微球为基质的填料或采用多配位基有机硅胶为填料。2021/7/13332021/7/13332、pH引入次级化学平衡（电离、络合、离子对等）改变溶质的浓度或存在形式，用以提高选择性。2021/7/13342021/7/13342021/7/13352021/7/13352021/7/13362021/7/13363、柱外效应UPLC的技术要求V池＜0.1V柱（2—5ul）V管路＜0.1V柱（0.1mm,id）V进样＜0.15V峰（2—5ul）tC＜0.1tR（10—15S，自动进样器）V死＜0.3ml2021/7/13373、柱外效应UPLC的技术要求2021/7/1337死体积的影响●延迟出峰时间●减低柱效●使梯度曲线变形2021/7/1338死体积的影响2021/7/1338四、UPLC（UFLC）的评估1、优势：●柱效高●运行时间短●适用于高通量筛选●便于与MS联用2021/7/1339四、UPLC（UFLC）的评估1、优势：2021/2、短处：●高柱压降（泵，摩擦生热导致柱效下降和选择性变化）●色谱成分残留●进样器交叉污染●供试液需径0.2u滤膜过滤●可选色谱柱有限●不太适合生物学基质样品●不适用于常规质量控制●尚未通过GLP认证2021/7/13402、短处：2021/7/13403、综合评估a）结合效率和成本考虑，在不少情况下2u的填料未必比3u的填料有太多的优势

2021/7/13413、综