局麻药布比卡因诱导卵巢癌和前列腺癌细胞凋亡及其机制研究

局麻药布比卡因诱导卵巢癌和前列腺癌细胞凋亡及其机制研究第一部分布比卡因对肿瘤细胞活性及耐药性的影响目的：明确布比卡因是否有抑制肿瘤细胞活性的作用,并观察布比卡因处理后是否能增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。验证布比卡因的促肿瘤细胞凋亡作用是否通过调控凋亡蛋白酶的活性。方法：体外培养人卵巢癌细胞(SKOV-3)、前列腺癌细胞(PC-3)和正常肾小管上皮细胞(HK-2),实验前将肿瘤细胞种植在24孔细胞培养板中,24小时后细胞达到70%-80%融合度时开始试验。实验组肿瘤细胞培养基中加入不同容积布比卡因以达到1μM、10μM、100μM、1mM四种不同的终浓度,对照组加入相等容积的生理盐水,继续培养24h或72小时后用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)比色法检测肿瘤细胞的活性。为比较布比卡因对肿瘤细胞和正常细胞作用的差异性,将正常的人肾小管上皮细胞(HK-2)与1mM布比卡因共同培养24小时后,用MTT比色法测定细胞的活性。在观察布比卡因与抗肿瘤药物共同作用的实验组中,加入l00μM、1mM布比卡因的同时给予治疗浓度的抗肿瘤药物紫杉醇(taxol),共同培养24小时后同样以MTT比色法测定肿瘤细胞的活性。凋亡蛋白酶检测组加入1mM布比卡因,24小时后免疫荧光染色法测定细胞中活性凋亡蛋白酶caspase3、caspase8和caspase9的表达量。之后使用相应蛋白酶抑制剂和FAS配体中和抗体处理,观察凋亡相关蛋白酶和细胞膜表明死亡受体在布比卡因诱导的肿瘤细胞凋亡中的作用。结果：MTT法检测细胞活性的结果显示,只有最高实验浓度(1mM)的布比卡因在24和72小时的培养后均显著抑制了SKOV-3和PC-3肿瘤细胞的活性。100μM组肿瘤细胞活性虽可见轻微下降,但未及显著性差异。SKOV-3和PC-3肿瘤细胞在1mM布比卡因存在下培养72小时后细胞活性下降的程度明显大于24小时,表明布比卡因对肿瘤细胞活性的抑制随时间的延续逐步增加。SKOV-3细胞活性下降的程度较PC-3更大,体现局麻药布比卡因对不同癌细胞的差异性杀伤作用。HK-2细胞在1mM布比卡因处理24小时的情况下细胞活性轻微下降,而无显著性差异,说明了局麻药有效的杀伤作用更多的体现在肿瘤细胞上,提示我们其可能干扰的是肿瘤细胞特异的生存条件。将100μM、1mM布比卡因与紫杉醇混合培养肿瘤细胞时,表现出的是布比卡因与抗肿瘤药物对肿瘤细胞的叠加杀伤效应,而非协同效应。免疫荧光分析显示,1mM布比卡因处理24h后,SKOV-3细胞中活性caspase3,8和9的表达均明显上升,Caspase8和9抑制剂部分逆转了SKOV-3的凋亡。PC-3细胞中只有活性caspase3和9的表达上调,而caspase8未见改变,同时只有caspase9抑制剂部分逆转了布比卡因诱导的肿瘤细胞凋亡,caspase8抑制剂无效。最后,FAS配体中和抗体处理后并未改变布比卡因引起的肿瘤细胞凋亡。结论：布比卡因能够显著抑制肿瘤细胞活性,且具有剂量和时间依赖性。其诱导肿瘤细胞凋亡的作用与凋亡蛋白酶的激活有关,与细胞膜表明死亡受体无关。第二部分布比卡因对肿瘤细胞增殖与迁移能力的影响目的：明确布比卡因是否有抑制肿瘤细胞增殖和迁移力的作用。方法：体外培养卵巢癌(SKOV-3)和前列腺癌(PC-3)细胞,增殖实验前将肿瘤细胞种植在置有玻片的24孔板上,在24孔板中培养24小时后细胞达到70%-80%融合度时开始试验。细胞增殖实验中肿瘤细胞SKOV-3和PC-3的培养基中加入1mM布比卡因后培养24h,之后免疫荧光染色法测定细胞增殖重要标记物ki67蛋白的表达量。肿瘤细胞迁移实验中使用划痕实验。迁移实验前将肿瘤细胞终于细胞培养皿中,24小时后当其铺满皿底形成单细胞层后开始实验。用一毫升枪头尖端在皿底做“十”字形划痕并在皿底座标记,以保证位置固定,显微镜下拍照记录划痕造成的间隙形态。之后肿瘤细胞培养液中加入浓度1mM的布比卡因,培养24小时后再次显微镜下拍照记录划痕形态,用Image-ProPlus软件比对前后缺损面积的变化,根据公式(初始缺损面积-最终缺损面积)/初始缺损面积,计算出创伤愈合率,由此估算细胞整体迁移率。结果：荧光强度分析结果显示,培养基中加入1mM布比卡因培养24小时后,SKOV-3和PC-3细胞中Ki67的表达均显著下降,表明1mM布比卡因有效抑制了这两种肿瘤细胞的增殖能力。细胞迁移实验中,SKOV-3和PC-3在1mM布比卡因的影响下,较对照组的创伤愈合率显著下降,表明其细胞迁移能力因布比卡因的存在而下降。结论：布比卡因能有效抑制SKOV-3和PC-3肿瘤细胞的增殖能力和迁移率。第三部分GSK-3β在布比卡因诱导的肿瘤细胞凋亡中的影响目的：探索GSK-3β的活性对布比卡因诱导的SKOV-3和PC-3肿瘤细胞凋亡有何种影响。方法：体外培养卵巢癌(SKOV-3)和前列腺癌(PC-3)细胞,实验前将肿瘤细胞种植玻片上,在24孔板中培养24小时后细胞达到70%-80%融合度时开始试验。在lmM布比卡因处理24小时后,免疫荧光法测定磷酸化的总GSK-3β、活化型GSK-3β(GSK-3βtyr216)以及抑制型GSK-3β(GSK-3βser9)的量。其它实验在1mM布比卡因加入培养液的基础上,用GSK-3抑制剂SB-216763抑制其活性,观察肿瘤细胞存活情况。再应用基因沉默技术用siRNAsc-35527沉默GSK-3β基因,在此基础上加入1mM布比卡因,培养24小时后用免疫荧光技术观察凋亡相关蛋白酶Caspase3,Caspase8,Caspase9的表达情况,以及最终肿瘤细胞的生存情况。结果：实验结果显示1mM布比卡因作用24小时后,SKOV-3磷酸化的总GSK-3β、GSK-3βryr216和GSK-3βser9均有显著增加,其中代表GSK-3β活性的磷酸化GSK-3βtyr216升高最为明显,有将近一倍的提升。而PC-3中磷酸化的总GSK-3β、GSK-3βtyr216和GSK-3βser9均无显著改变。抑制剂和SiRNA的运用都部分减轻了布比卡因诱导的SKOV-3细胞凋亡,但这些作用并未在PC-3细胞上发现。在沉默GSK-3ββ基因后,我们发现GSK-3β仅有微弱表达,免疫荧光分析显示,凋亡相关蛋白酶Caspase3,Caspase8,Caspase9的表达随着GSK-3β基因的沉默也显著下降。结论：1mM布比卡因