体外培养星形胶质细胞α7尼古丁型乙酰胆碱能受体调控β-淀粉样蛋白聚集的作用

体外培养星形胶质细胞α7尼古丁型乙酰胆碱能受体调控β-淀粉样蛋白聚集的作用目的:研究激活星形胶质细胞内的α7尼古丁乙酰胆碱能受体(nicotinicacetylcholinereceptor,nAChR)后对调控β-淀粉样蛋白(β-amyloidpeptide,Aβ)聚集的作用。方法:分离新生大鼠大脑皮质,培养原代星形胶质细胞并纯化、传代,使用细胞免疫荧光的方法鉴定细胞及纯度;体外制备Aβ寡聚体;将培养细胞分为对照组、激动剂组、拮抗剂+激动剂组以及Aβ组、激动剂+Aβ组、拮抗剂+激动剂+Aβ组。激动剂有尼古丁、PNU、s24795,拮抗剂为甲基牛扁亭(methyllycaconitine,MLA)。用蛋白印迹法(Westernblotting)和逆转录PCR(reversetranscription,PCR)法检测正常星形胶质细胞内nAChR不同亚单位的表达;蛋白印迹法和凝胶银染方法鉴定Aβ寡聚体聚集情况;用CCK-8方法测定星形胶质细胞的存活率;使用蛋白印迹法检测加入激动剂后α7nAChR的表达以及Aβ蛋白是否降解。结果:采用免疫荧光法鉴定所培养的细胞,结果显示星形胶质细胞占所有细胞的95%以上。除β3外,星形胶质细胞中α2、α3、α4、α7及β2nAChR亚单位在蛋白及mRNA水平均有表达。体外制备的Aβ除了含少量的未聚集的单体(4kDa)外,主要以二聚体、三聚体、九聚体等不同聚集形式的寡聚体存在;CCK-8方法显示Aβ寡聚体对星形胶质细胞有明显的神经毒性作用,并呈现剂量-效应关系。检测α7nAChR蛋白表达结果显示:(1)尼古丁组与对照组比较,尼古丁组的α7nAChR表达明显增高(P<0.01),MLA+尼古丁组与尼古丁组比较,加入拮抗剂组的α7nAChR表达降低(P<0.05);(2)PNU组与对照组比较,PNU组的α7nAChR的表达增加(P<0.05),MLA+PNU组与PNU组相比,α7nAChR表达降低(P<0.05);(3)s24795组与对照比较,s24795组的α7nAChR表达明显升高(P<0.01),MLA+s24795组与s24795组比较,加入拮抗剂组的α7nAChR表达明显降低(P<0.01)。检测Aβ蛋白的表达结果为:(1)收集细胞的上清液及蛋白,分别进行检测。对照组正常的细胞内没有Aβ蛋白的表达,尼古丁+Aβ组与Aβ组相比,尼古丁+Aβ组的Aβ蛋白表达均明显降低(P<0.01),MLA+尼古丁+Aβ组与尼古丁+Aβ组比较,MLA+尼古丁+Aβ组的Aβ蛋白的表达均明显升高(P<0.01);(2)收集细胞的上清液及蛋白,分别进行检测。对照组正常的细胞内没有Aβ蛋白的表达,PNU+Aβ组与Aβ组相比,PNU+Aβ组的蛋白表达均明显降低(P<0.01),MLA+PNU+Aβ组与PNU+Aβ组比较,MLA+PNU+Aβ组的蛋白表达均升高(P<0.05);(3)收集细胞的上清液及蛋白,分别进行检测。对照组正常的细胞内没有Aβ蛋白的表达,s24795+Aβ组与Aβ组相比,s24795+Aβ组的Aβ蛋白表达均明显降低(P<0.01),MLA+s24795+Aβ组与s24795+Aβ组比较,MLA+s24795+Aβ组的Aβ蛋白的表达均明显升高(P<0.01)。结论:Aβ寡聚体对星形胶质细胞有明显的神经毒性作用。在星形胶质细胞有多种nAChRs亚单位的表达。细胞实验中,使用三种不同的激动剂刺激星形胶质细胞内α7