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文档简介
ICS07.080
B20/39
中华人民共和国国家标准
GB/TXXXXX—201X
核糖核酸酶活力测定
Determinationoftheactivityofribonuclease
(征求意见稿)
201X-XX-XX发布201X-XX-XX实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
发布
中国国家标准1化管理委员会
GB/T××××—201×
核糖核酸酶活力测定
1范围
本标准规定了核糖核酸酶活力测定原理、仪器设备及器具、主要试剂、分析步骤和结果分析。
本标准适用于生化试剂核糖核酸酶活力测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
3.1
核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)
水解核糖核酸(RNA)中磷酸二酯键,生成寡核苷酸或单核苷酸核酸的核酸酶。根据酶作用的位置不
同,可进一步分为内切核糖核酸酶与外切核糖核酸酶。
3.2
核糖核酸酶活力单位(ribonucleaseactivityunit)
以浓度为0.15mg/mL的1.5ml酵母RNA为底物,在50℃且pH5.0的条件下,1分钟内使反应液在260nm
处吸光度增加0.001所需要的酶量为一个活性单位(U)。
4原理
核糖核酸酶催化产物在260nm波长下具有特征吸收峰,通过外标法计算核糖核酸酶的活性。
5仪器设备及器具
5.1恒温水浴槽。
5.2紫外-可见分光光度计:吸光度精确至0.001。
5.3pH计:精确至0.01。
5.41cm石英比色皿。
5.5电子天平:精度为0.0001g和0.01g。
6试剂
1
GB/T××××—201×
本方法所用试剂均为分析纯,除特殊说明外,实验用水均为GB/T6882规定的二级水。
6.10.1mol/L乙酸/乙酸钠(NaAc/HAc)缓冲液,pH5.0
称取8.20gNaAc溶于水中,缓慢加入HAc调pH至5.0,混匀后定容至1000ml。
6.2酵母核糖核酸
来源于圆酵母(TorulaYeast),含量≥98%。
7分析步骤
7.1环境要求
所有试验操作步骤应在洁净的无外源RNA酶环境中进行。
7.2试验液的制备
7.2.1酵母RNA溶液
称取酵母RNA15.0mg溶于水中,使其溶液浓度为0.15mg/mL。
7.2.2固体样品待测酶液制备
称取28.0mg样品,溶于水中,调节核糖核酸酶液初始浓度为0.7mg/mL。
7.2.3液体样品待测酶液制备
将液体待测酶样用水调节最后的溶液中核糖核酸酶液浓度为0.7mg/mL。
7.3酶促反应
同一样本取4只离心管,设置空白对照管1只,检测管3只,其中空白管中依次加入酵母RNA溶液
1.5mL、水0.5mL与NaAc/HAc缓冲液1.0mL;检测管中依次加入酵母核糖核酸(RNA)溶液1.5mL、
待测酶液0.5mL以及NaAc/HAc缓冲液1.0mL。每个待测酶液设定三个重复即3个检测管,50℃恒温水
浴反应时间为15min。
7.4分光光度分析
空白对照管标记为0号管,检测管分别标记为1-3号管,加样方法如表1所示,反应后在260nm处测
对照管和检测管溶液的吸光度,并记录结果。
表1待测样液加样方法
0号管1号管2号管3号管
酵母核糖核酸溶液(mL)1.51.51.51.5
水(mL)0.50.00.00.0
NaAc/HAc缓冲液(mL)1.01.01.01.0
待测酶液(mL)0.00.50.50.5
2
GB/T××××—201×
8结果分析
8.1酶活力计算
按照式(1)计算:
A1000稀释倍数
C260..........................................................(1)
15
式中:
C:核糖核酸酶活力(U/mL或U/g);
A260:检测管与空白对照管在260nm处测定得到的吸收值差;
1△000:吸光度原值与活力规定中规定吸光度0.001的换算系数。
15:反应时间与活力单位定义中的换算系数。
以平行样的平均值为最终的酶活力测定值,计算结果保留整数位。
8.2重复性
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