鼠疫检测新技术新方法

关于鼠疫检测新技术新方法一、核酸检测技术（PCR检测）二、标记检测技术（ELISA，胶体金）第2页,共38页，2024年2月25日，星期天一、核酸检测技术定义：对动植物、微生物的基因序列进行测定。

核酸的分离与纯化内容：聚合酶链式反应(PCR技术)

核酸杂交技术第3页,共38页，2024年2月25日，星期天核酸的纯化与分离目的：获得完整的核酸一级结构，并提高核酸纯度。

破碎细胞（细菌）

技术流程核酸提取

核酸纯化第4页,共38页，2024年2月25日，星期天材料的前处理细胞破碎，核酸释放核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，去除杂质核酸溶解缓冲液第5页,共38页，2024年2月25日，星期天全自动核酸、蛋白提取仪第6页,共38页，2024年2月25日，星期天聚合酶链式反应（PCR技术）

简史：1971年，Khorana提出：DNA变性后，与合适引物进行杂交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不断重复该过程，即可克隆tRNA基因。1985年，Mullis等人发明聚合酶链反应（PCR），随后，Mullis所属公司PE推出第一台PCR自动化热循环仪。第7页,共38页，2024年2月25日，星期天基本原理：第8页,共38页，2024年2月25日，星期天基本步骤第9页,共38页，2024年2月25日，星期天第10页,共38页，2024年2月25日，星期天实时定量PCR仪PCR仪第11页,共38页，2024年2月25日，星期天凝胶成像系统凝胶电泳系统第12页,共38页，2024年2月25日，星期天PCR结果判定（凝胶电泳）第13页,共38页，2024年2月25日，星期天PCR类型：

1.多重PCR

2.巢式PCR

3.定量PCR

4.反向PCR

5.逆转录PCR

第14页,共38页，2024年2月25日，星期天PCR技术在鼠疫检测中的应用鼠疫菌PCR检测法：从疑似鼠疫的标本（全血、组织）中检测鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作为PCR扩增目的片段。鼠疫判定标准：PCR扩增（fra+

pla）

+

胶体金抗原检测or酶联免疫吸附试验or反相血凝试验=确诊鼠疫第15页,共38页，2024年2月25日，星期天鼠疫菌核酸检测样本处理样本类别1.鼠疫菌培养物2.鼠疫病人血液、痰液或尸检标本3.自毙或捕获动物血液或组织脏器（肝脏、脾脏等）4.媒介昆虫第16页,共38页，2024年2月25日，星期天样品处理方法1.煮沸法2.DNA提取试剂盒3.CTAB法4.氯仿抽提法第17页,共38页，2024年2月25日，星期天第18页,共38页，2024年2月25日，星期天鼠疫菌PCR检测反应体系10xbufferdNTPsFra-F（5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’）Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）Pla-F（5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’）Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）Taq聚合酶待检测模板（基因组DNA）去离子水第19页,共38页，2024年2月25日，星期天鼠疫菌PCR检测反应程序预变性95℃5min1个循环变性95℃1min退火72℃1min延伸72℃1min变性72℃5min30个循环第20页,共38页，2024年2月25日，星期天M123456内参基因PlaFra鼠疫PCR检测电泳结果判定阳性结果：内参基因+Pla+Fra阴性结果：内参基因第21页,共38页，2024年2月25日，星期天核酸杂交技术

待检测DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针用放射性或非放射性标记。在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。第22页,共38页，2024年2月25日，星期天二、标记检测技术标记技术：用标记物质荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。通过测定标记物-抗原-抗体复合物来定性或定量的检测标本中的抗体或抗原。第23页,共38页，2024年2月25日，星期天标记检测特点：标记免疫技术=免疫技术+

标记技术抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性第24页,共38页，2024年2月25日，星期天鼠疫标记检测技术ELISA胶体金第25页,共38页，2024年2月25日，星期天ELISA技术原理：1.使抗原或抗体结合到到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.2.在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面抗原抗体反应.3.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质量成一定比例.4.加入底物,通过颜色变化来测定.第26页,共38页，2024年2月25日，星期天ELISA的类型：间接法第27页,共38页，2024年2月25日，星期天双抗夹心法第28页,共38页，2024年2月25日，星期天ELISA技术在鼠疫检测中的应用1.检测鼠疫F1抗原（or抗体）原理：以双抗体夹心法测定F1抗原为例。采用F1抗体包被反应板，加入待测标本，反应除去未结合物质，加入HRP-F1MCAb，如待测标本中含有F1抗原时就与包被F1抗体、HRP-F1抗体结合形成复合物，加入OPD底物产生显色反应，反之就无显色反应。所需试剂及器材：HRP-F1McAb冻干剂，F1McAb包被板，鼠疫F1阳性对照、阴性对照，PBS（稀释液）,显色液（邻苯二胺），终止液（2M硫酸）。ELISA检测工作站，ELISA洗板机、振荡器等第29页,共38页，2024年2月25日，星期天第30页,共38页，2024年2月25日，星期天第31页,共38页，2024年2月25日，星期天ELISA结果判读：1.目测：平持反应版，距白色背景5-10cm，从板的正上方观察。（+++）深黄棕色；（++）浅黄棕色；（+）颜色明显可见；（-）无色或颜色很浅2.ELISA检测工作站

标本OD/阴性OD>2.1位阳性。

第32页,共38页，2024年2月25日，星期天ELISA操作注意事项：（一）加样

加样时应将所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

加标本一般用微量加样器，每次加标本应更换吸头，以免交叉污染。（二）保温

在Elisa中一般有二次抗原抗体反应，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。

为避免蒸发，板上应加盖，或将平板置于湿盒中。第33页,共38页，2024年2月25日，星期天（三）洗涤

洗涤的目的是吸取反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤一般采用以下方法：1、吸干孔内反应液。2、将洗涤液注满孔板。3、放置3分钟，略作摇动。4、吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干，洗涤次数3-4次，又是需洗5-6次。（四）显色和比色

显色的最后一部是温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物，反应温度和时间仍是影响显色的因素，在定量测定中加入底物后的温度和时间应按规定力求准确，而在定性测定中，可根据显色程度适当提高温度，或者适当缩短或延长反应时间。第34页,共38页，2024年2月25日，星期天胶体金检测技术：原理：将F1-McAb抗体以条带状固定在NC膜上，胶体金标记F1-McAb吸附在结合垫上，与待测样品反应，通过目测