孕期尼古丁暴露所致子代大鼠肾上腺皮质酮合成功能改变及其宫内起源机制

孕期尼古丁暴露所致子代大鼠肾上腺皮质酮合成功能改变及其宫内起源机制宫内发育迟缓(intrauterinegrowthretardation,1UGR)是最常见的发育毒性之一,不仅引起近期危害(如胎儿窘迫、新生儿窒息和围产儿死亡),而且其危害还将延续到出生后,表现为出生后体格、智力发育落后和成年后代谢综合征易感性增加。孕期母体暴露于烟雾是IUGR发生的最确切诱因之一。尼古丁(nicotine)是烟草中的主要生物碱,因为脂溶性特征,极易通过胎盘在胎儿体内蓄积,影响胎儿发育。孕期尼古丁暴露是导致IUGR发生的重要原因。越来越多的研究表明,下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴编程改变是IUGR易发生成年代谢综合征的关键机制。肾上腺是HPA轴的终端效应器官,负责多种甾体激素的合成,对维持正常妊娠、促进胎儿生长和神经系统发育有重要意义。低出生体重所致的肾上腺糖皮质激素(在人为皮质醇,在啮齿类动物为皮质酮)分泌紊乱是出生后代谢综合征易感的主要原因。因此,肾上腺甾体合成功能的编程改变在IUGR成年代谢综合征易感的过程中起到重要作用。本室前期发现,孕期尼古丁暴露可抑制胎肾上腺甾体合成的关键和限速酶—急性调节蛋白(steroidogenicacuteregulationprotein,StAR)和P450侧链裂解酶(cytochromeP450cholesterolsidechaincleavage,P450scc),导致皮质酮合成降低和IUGR发生;细胞实验证实,尼古丁暴露能直接降低原代人胎肾上腺皮质细胞StAR和P450scc表达及皮质醇合成。提示,胎肾上腺是尼古丁暴露的毒性靶器官,尼古丁对肾上腺有直接毒性作用。然而,尼古丁如何影响IUGR胎肾上腺皮质酮合成具体机制还不清楚,尼古丁暴露的IUGR胎儿出生后各时期肾上腺甾体合成酶系统及功能如何改变也未见相关报道。类固醇合成因子-1(steroidogenicfactor-1,SF-1)在肾上腺皮质形态发生和类固醇激素合成基因转录调控方面均发挥重要作用,所有甾体合成酶基因的启动子区均存在SF-1识别序列。研究证实,尼古丁暴露可引起DNA甲基化和/或组蛋白乙酰化改变,导致基因表达异常。DNA甲基化抑制剂或组蛋白去乙酰化抑制剂可以降低SF-1表达而影响甾体激素的分泌。另一方面胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor1,IGF-1)及其受体IGF-1R广泛表达于肾上腺皮质,可通过磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt)通路调节SF-1及相关甾体合成酶系统的表达,促进甾体激素的合成。提示,尼古丁暴露可能通过影响肾上腺IGF-1信号通路或SF-1表遗传修饰及表达,改变胎肾上腺甾体合成酶的表达,从而编程肾上腺皮质酮的合成功能。本研究在孕期尼古丁暴露所致的大鼠IUGR模型上,系统观察了出生前、出生后正常或高脂饮食下,胎肾上腺SF-1表达、甾体合成酶系统、IGF-1信号通路以及肾上腺皮质酮水平变化；进一步从SF-1启动子区DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰角度,证实尼古丁所致胎肾上腺甾体合成酶表达改变的表观遗传机制。本研究对于全面认识尼古丁的发育毒性,指导孕期健康生活,降低IUGR出生率及成年慢性疾病易感性,提高人口质量,具有重要的理论价值和现实意义。第一部分孕期尼古丁暴露所致胎肾上腺皮质酮合成功能抑制目的：利用整体动物实验,研究孕期尼古丁暴露对胎肾上腺的甾体合成酶系统基因表达、IGF-1信号通路以及皮质酮合成功能的影响,并从SF-1的DNA甲基化和组蛋白修饰角度,探讨其表达调控机制。方法：受孕大鼠随机分为对照组和尼古丁组,孕11日(gestationalday1,GD11)皮下注射2mg/kg-d(每天分两次注射),建立孕中、晚期尼古丁暴露所致大鼠IUGR模型,气质联用分析仪检测母鼠和胎鼠血中尼古丁含量；苏木精-伊红染色和透射电镜观察肾上腺组织和细胞病理学变化；酶联免疫吸附(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)技术检测胎肾上腺内生皮质酮和血IGF-1含量；实时定量PCR技术检测胎肾上腺StAR.P450scc,3p羟类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroiddehydrogenase,3βHSD)、类固醇11β-羟化酶(steroid11β-hydroxylase,P450c11)、类固醇21-羟化酶(steroid21-hydroxylase,P450c21)、SF-1、IGF-1信号通路(1GF-1、IGF-1R、AKT1)、黑皮素受体2(melanocortinreceptor2,MC2R)、DNA甲基转移酶(DNAMethyltransferase,Dnmts)和组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases,HDACs)mRNA表达；免疫组化技术检测胎肾上腺SF-1的蛋白表达；亚硫酸氢盐修饰后测序(bisulfitesequencePCR,BSP)检测SF-1启动子区DNACpG位点甲基化修饰情况：染色质免疫沉淀(chromatinimmunoprecipitation,ChIP)检测SF-1启动子区组蛋白乙酰化修饰情况。结果：①出生体重与IUGR发生率：与对照组相比,胎鼠的平均体重降至对照组的87.5%(P<0.01),IUGR率达到85.8%(P<0.01)。②血尼古丁含量：尼古丁含量(μM)在母血为5.39±0.27,在胎血为3.71±0.15(P<0.05),胎血尼古丁浓度为母血尼古丁平均含量的68.8%。③病理学改变：尼古丁组的胎肾上腺细胞浆淡染,细胞肿胀；电镜下可观察到线粒体管状结构排列紊乱、数量减少,线粒体膜状结构破坏,内容物溢出,核周间隙变宽。④胎肾上腺皮质酮合成功能改变：与对照组相比,胎肾上腺内生皮质酮含量降低(P<0.05)。胎肾上腺StAR、3βHSD和P450c11mRNA表达降低(P<0.05),SF-1mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。⑤血及肾上腺IGF-1信号通路：与对照组相比,雄性尼古丁组胎血IGF-1含量降低(P=0.07),胎肾上腺IGF-1R和AKT1mRNA表达显著增加(P<0.01)；雌性胎血IGF-1含量降低明显(P<0.05),胎肾上腺IGF-1R和AKT1mRNA显著降低(P<0.01)；肾上腺IGF-1和MC2RmRNA均未改变。⑥SF-1启动子区的表遗传修饰变化：与对照组相比,尼古丁组的胎肾上腺Dnmtl和Dnmt3amRNA表达分别增加67.3%和42.9%(P=0.07),HDAC2mRNA表达增加(P<0.05);CHIP技术检测-832～-653和-334～-172区域H3K9和H3K14组蛋白修饰,发现尼古丁组H3K9组蛋白乙酰化修饰分别降至对照组的54.58%和58.83%(P<0.05),H3K14组蛋白乙酰化修饰未见明显改变；尼古丁组SF-1启动子区(-260-+60bP)总甲基化率和单个位点甲基化率均未出现改变。结论：孕期尼古丁暴露所致IUGR仔鼠存在胎肾上腺皮质酮合成功能抑制,其发生机制一方面与SF-1组蛋白去乙酰化修饰及表达降低有关,另一方面与低血IGF-1引起胎肾上腺IGF-1信号通路表达降低有关。第二部分尼古丁暴露所致人胎肾上腺细胞皮质醇合成功能抑制目的：在细胞水平,研究尼古丁对胎肾上腺细胞NCI-H295A甾体激素合成功能的影响,并从SF-1组蛋白乙酰化修饰的角度探讨其机制。方法：常规培养人胎肾上腺皮质细胞-NCI-H295A细胞系,不同浓度(0、25和50μM)尼古丁处理细胞5天,或50μM尼古丁处理细胞不同时间(0、3和5天)。MTT法检测细胞毒性,ELISA检测培养基中皮质醇和硫化脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone-sulfate,DHEAS)含量,实时定量PCR检测甾体合成酶(StAR、P450scc和P450c17)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC7A)和SF-1mRNA表达,Westernblot和/或免疫组化检测SF-1蛋白表达,曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)330nM和/或尼古丁50μM处理细胞5天,实时定量PCR检测SF-1的mRNA表达,CHIP检测SF-1启动子区组蛋白乙酰化修饰情况。结果：①细胞毒性：尼古丁(0、25和50μM)处理细胞5天时活细胞数量无明显改变。②皮质醇和DHEAS生成量：与对照相比,尼古丁组培养基中皮质醇和DHEAS分泌量呈剂量和时间依赖性降低(P<0.05,P<0.01)。③甾体合成酶和SF-1表达：与对照组相比,尼古丁处理细胞中StAR、P450scc、P450c17和SF-1mRNA表达呈浓度依赖性降低(P<0.05,P<0.01);WesternBlotting和免疫组化的结果表明,SF-1的蛋白表达量呈浓度依赖性降低(P<0.05)。④组蛋白去乙酰化酶表达：尼古丁组HDAC1、HDAC2和HDAC7AmRNA表达呈浓度依赖性增加(P<0.05,P<0.01)。HDAC3mRNA表达无变化。⑤SF-1启动子组蛋白乙酰化修饰：与对照组相比,细胞SF-1启动子组蛋白乙酰化修饰(H3K9和H3K14)分别降至对照组的37.7%(P<0.01)和22.9%(P<0.01)。⑥TSA抑制性实验：与对照组相比,TSA处理细胞后,SF-1的mRNA表达增加1.5倍(P<0.01),与尼古丁组相比,SF-1的mRNA表达增加2.2倍(P<0.01)。结论：尼古丁暴露可直接抑制胎肾上腺细胞甾体合成酶系统及功能,其机制可能与SF-1去乙酰化修饰改变有关。第三部分尼古丁致IUGR仔鼠正常饮食下肾上腺皮质酮合成功能变化目的：孕期尼古丁暴露所致IUGR成年鼠模型上,观察出生后在正常饮食喂养下,不同时期HPA轴活性、肾上腺甾体合成酶系统和IGF-1信号通路基因的表达变化以及之间的联系,证实孕期尼古丁暴露所致子代大鼠肾上腺皮质酮合成功能的编程性改变。方法：第一批动物：建立孕期尼古丁(2mg/kg-d每天分两次注射)暴露所致大鼠IUGR模型,自然生产后,记录体重增长情况,并给予正常饮食,将每只母鼠的仔鼠随机分成4组,按照出生后天数(postnatalday,PD)分别分为PD1、PD7、PD35和PD100,不同时间点断头取血和肾上腺组织,其中PD1、PD7和PD35胎组织分别来自同一母鼠的4、3和2只血或仔鼠组织合并成一个标本。第二批动物：建立孕期尼古丁暴露大鼠IUGR模型,自然生产,并予以正常饮食至PD150,断头取血和肾上腺组织。ELISA检测血促肾上腺皮质激素(adreno-cortico-tropic-hormone,ACTH)、皮质酮和1GF-1浓度,实时定量PCR检测肾上腺组织甾体合成酶系统(SF-1、StAR、P450scc、3pHSD、P450c21和P450c11)、IGF-1信号通路(IGF-1、IGF-1R、AKT1和MC2R)mRNA表达。结果：①体重变化：与对照组相比,尼古丁组暴露仔鼠PD1至PD150平均体重明显降低(P<0.05.P<0.01)①HPA轴活性变化：与对照组相比,尼古丁组血ACTH和CORT浓度在出生后早期(PD1、PD7和PD35)显著增加(P<0.05,P<0.01),PD60至PD150降低(P<0.01)。③肾上腺甾体合成酶系统表达变化：与对照组相比,尼古丁组动物PD100时,以StAR、P450scc、P450c11和SF-1降低明显(P<0.05,P<0.01).PD150时,3βHSD和P450c21在雄性动物中表达增加(P<0.01),而在雌性表达降低(P<0.01),SF-1表达均明显增加(P<0.01)。④血IGF-1和肾上腺IGF-1言号通路表达变化：与对照组相比,尼古丁组动物血IGF-1均显著增加(P<0.05),肾上腺IGF-1、IGF-1R和AKT1mRNA表达在雄性PD150增加(P<0.01),IGF-1、AKT1和MC2RmRNA表达在雌性PD150降低(P<0.05,P<0.01)。结论：孕期尼古丁暴露所致IUGR仔鼠肾上腺SF-1及甾体合成功能的改变可延续到出生后甚至成年；正常饮食下,雄性肾上腺IGF-1信号通路表达增强,可部分增强肾上腺皮质酮合成功能,而雌性IGF-1信号通路表达变化不明显。第四部分尼古丁致IUGR仔鼠高脂饮食下肾上腺皮质酮合成功能变化目的：模拟目前社会人群高脂饮食习惯,进一步观察孕期尼古丁暴露所致的IUGR仔鼠,出生后在高脂饮食下的肾上腺皮质酮合成功能改变,并分析其发生机制。方法：动物受孕处理方法同前,断奶后给予高脂饲料饲养(含89.5%玉米粉、10%猪油和0.5%胆固醇)至PD150。在PD120时,每4h尾静脉取血,持续24h,用于测ACTH昼夜节律。PD150异氟烷麻醉处死大鼠,取血和肾上腺组织。放免法测定大鼠血清ACTH浓度,ELISA检测血皮质酮和IGF-1浓度,实时定量PCR检测肾上腺组织甾体合成酶系统(SF-1、StAR、P450scc、3βHSD、P450c21和P450c11)、IGF-1信号通路(IGF-1、IGF-1R、AKT1和MC2R)mRNA表达。结果：①体重变化：孕期尼古丁暴露仔鼠出生后一周,雄性和雌性仔鼠体重明显低于高脂对照组(P<0.01)。断奶后予以高脂饮食,PD150时尼古丁暴露的雌性和雄性仔鼠体重接近甚至超过高脂对照组。②ACTH昼夜节律及HPA轴活性：与对照组相比,尼古丁组雄性动物血ACTH浓度增加