T-SHRH 023-2019 化妆品屏障功效测试 体外重组3D表皮模型 测试方法

71.100.70C2682Y42

T/SHRH

023-2019________________________________________________________________________________________

test

cosmetics

In

vitro

skin

test

T/SHRH

023-2019 前言…………… 21

32.

规范性引用文件………… 33.

术语、定义……………… 34.

试验原则………………… 35.

试剂及仪器设备………… 36.

试验步骤………………… 47.

结果计算………………… 58.

质量控制………………… 59.

结果判定………………… 6附录

A

7T/SHRH

023-2019 本标准按照

GB/T1.1-2009

给出规则起草。本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。公司、上海创元化妆品有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海绿瑞生物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海日用化学品行业协会。本标准主要起草人：李潇、张艳云、韩波、曹平、陈田、陈静、聂菁、曾四立、吴梅芳、陈贞明、谢阿贵、廖峰、姜春鹏、赵奕竹、马骁、王飞飞、李琼、金坚、陈亦华。T/SHRH

023-2019化妆品屏障功效测试

体外重组

表皮模型测试方法1 范围本标准规定了一种基于体外重组

表皮模型的化妆品原料及成品的屏障功效测试方法。本标准适用于具有屏障提升作用的化妆品原料及驻留型化妆品成品的屏障功效性测试，不适用于洗去型化妆品。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法GB/T

化学品

体外皮肤腐蚀

人体皮肤模型试验方法化妆品安全技术规范3 术语、定义3.1

viability测定细胞群体总活力的指标

[如细胞线粒体脱氢酶还原活性染料噻唑蓝（3-（4，5-二甲基噻唑），5-二苯基四氮唑溴盐，MTT]总数和活性细胞数量有关。3.2

半数有效时间

，ET待测物在固定浓度下导致细胞存活率降低

50％所需的暴露时间。3.3

吸光度

optical

OD种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。4 试验原则4.1

3D

表皮模型（EpiKutis®），具有表皮的复层化结构（基底层、棘层、颗粒层和角质层）和屏障功能。刺激物十二烷基硫酸钠（）接触模型，造成皮肤屏障与模型组织的损伤。4.2

屏障提升功效是通过一系列的物理、生物化学的作用，提升皮肤活细胞层与角质层的结构功能，达到提升皮肤屏障功能的作用。的提升作用。5 试剂及仪器设备5.1

试剂和材料5.1.1

体外重组

表皮模型（®）。T/SHRH

023-20195.1.2

体外重组

表皮模型培养液（EpiGrowth

培养液）。5.1.3

磷酸盐缓冲液（PBS）。5.1.4

X-100

(1%，V/V)。5.1.5

（CAS

）。5.1.6

异丙醇。5.1.7

阴性对照：十二烷基硫酸钠（0.2%

）。5.1.8

阳性对照：WY14643（α

激活剂）。5.2

仪器和设备5.2.1

移液器：

活塞排代式移液器及相应吸头，20μL~200μL、100μL~1000μL

移液器及相应吸头。5.2.2

培养箱：37℃±1℃，（5±1），95%相对湿度。5.2.3 酶标仪：570nm。5.2.4 超净工作台。5.2.5 水平振荡仪。5.2.6 分析天平（精度

）。6 试验步骤6.1

对照设置

9

ET测定中设置了

3

个时间点，每个时间点

3

个模型重复，总计

9

个模型）。6.2

测试准备阴性对照与阳性对照的工作液按照附录

A

配制。6.3

待测物预处理吸取

200µL

溶液（）和

µL

待测物置于

1.5mL

离心管中，旋涡混匀。6.4

模型准备根据试验组别及模型数量，准备

6

孔板，并在相应孔中添加

的

EpiGrowth

培养液。6.5

化妆品成品给药方式对阴性对照组和阳性对照组，吸取

25μL

溶液（0.2%）涂抹于模型表面。对待测物组，吸取25μL

EpiGrowth

培养液中添加

μMWY14643。

6

孔板转移到

培养箱中孵育

24h（℃、、95%相对湿度）。化妆品原料给药方式对阴性对照组、阳性对照组和待测物组，吸取

25μL

溶液（0.2%）涂抹于模型表面。对待测物组，需在

EpiGrowth

培养液中添加相应浓度的待测物。对阳性对照组，需在

EpiGrowth

加

50μM

6

孔板转移到

培养箱中孵育

24h（37±1℃、、相对湿度）。6.6

T/SHRH

023-2019模型孵育培养结束后，开始清洗程序。用无菌

PBS

溶液重复清洗模型表面

次，去除残留的待测物。用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体，放入新标记的

6

孔板中，并在每孔中加入

EpiGrowth

培养液，用于

测定。6.7

测定：各组模型表面滴加

80µL

1%

，孵育时间设定为

0h，1h，3h，其中孵育时间设置为

0h的模型，不进行给药。模型孵育结束后，开始清洗程序。用无菌

PBS

溶液重复清洗模型表面

10

次，去除残留的。每个模型的清洗总时间控制在

1~2

。根据模型总数量准备

24

孔板，并向每孔加入

的

MTT

工作液。将模型转移至

24

孔板中，置于

培养箱中（℃、

、95%相对湿度），孵育

。MTT

液器吸弃

溶液，加入

300μLPBS

溶液，清洗模型外表面，重复此清洗过程

3

次。将模型外表面用无菌棉签擦干，转移到新的

24

孔板中，在模型内加入

2mL

异丙醇。用封口膜密封

24

孔板，于

4℃静置过夜或在水平震荡器上常温震摇

。从每孔中吸取

2

份

200μL

96

零对照，酶标仪

570nm

波长读取吸光度（OD）值。7 结果计算7.1

7.1.1

阳性对照组：阳性对照组各时间点组织活力=（阳性对照组各时间点

OD

值-调零对照

OD

值）/（阳性对照

0h

OD

值-调零对照

OD

。7.1.2

阴性对照组：阴性对照组各时间点组织活力=（阴性对照组各时间点

OD

值-调零对照

OD

值）/（阴性对照

0h

OD

值-调零对照

OD

。7.1.3

空白对照组：空白对照组各时间点组织活力=（空白对照组各时间点

OD

值-调零对照

OD

值）/（空白对照

0h

OD

值-调零对照

OD

。7.1.4

=（待测物组各时间点

OD

值-调零对照

OD

/（待测物组

0h

OD

值-调零对照

OD

值）。7.1.5

ET值计算以各组组织活力邻近

50%左右的两个时间点为横坐标，其对应组织活力为纵坐标，绘制折线图，计算线性回归方程。根据公式，计算组织活力为

时，对应的时间，即为该组的

8 质量控制8.1

基本原则：每批次试验均需设置空白对照、阴性对照和阳性对照。试验中设置的各种对照应符合以下标准。如任一种对照出现非下述标准，则视为质控不合格。8.2

阴性对照组：与空白对照组相比，模型组织活力（0h）下调

以上。同一孵育时间下三个重复模型组织活力标准偏差均小于等于

。8.3

阳性对照组：与阴性对照组相比，模型组织活力（0h）上调

15%以上。同一孵育时间下三个重复模型组织活力标准偏差均小于等于

。T/SHRH

023-20198.4

待测物组：同一孵育时间下三个重复模型组织活力标准偏差均小于等于

18%。9 结果判定以下条件说明待测物具有屏障提升功效:与阴性对照组相比，待测物

0h

OD

值上调，且有统计学显著性差异；与阴性对照组相比，待测物

值升高；如待测物满足上述部分条件，仍可说明待测物具有屏障提升功效。T/SHRH

023-2019附录

A（资料性附录）1. 阴性对照组母液的配制用分析天平称取

0.2g

，溶于

PBS，配制成

母液，使用前需用

0.22µm

滤膜过滤。2. 阴性对照组工作液配制用移液器吸取

25µL4%SLS

母液，