两面针质量控制及基于斑马鱼模型评价两面针和苍耳子初步毒性研究

两面针质量控制及基于斑马鱼模型评价两面针和苍耳子初步毒性研究目的:1.建立两面针药材薄层色谱鉴别、超高效液相色谱法(UltraPerformanceLiquidChromatography,UPLC)指纹图谱结合3个活性成分定量测定方法,旨在为两面针质量控制提供更为全面、有效的评价方法,为提高两面针质量标准提供依据;2.采用斑马鱼模型评价两面针水提取物的发育毒性,提供两面针水提取物的发育毒性数据;3.采用斑马鱼模型评价苍耳子水提取物的发育毒性和肝毒性,为其临床用药的安全性提供参考,旨在验证斑马鱼模型用于快速评价中药肝毒性的适用性。方法:1.以乙酸乙酯-甲醇-浓氨(25:1:0.2)为展开剂,采用薄层色谱法鉴别两面针及其伪品;2.采用UPLC法结合相似度评价、聚类分析和主成分分析,建立两面针药材UPLC指纹图谱,并进行精密度、重复性、稳定性考察。3.采用UPLC法同时测定两面针中氯化两面针碱、乙氧基白屈菜红碱和芝麻素3个活性成分的含量,并进行方法学考察;4.以正常发育受精后6小时(hourspost-fertilization,6hpf)斑马鱼为模型,评价两面针水提取物的发育毒性,在不同时间点观察两面针暴露处理后斑马鱼胚胎的发育情况,并对相应指标进行测定;5.以正常发育受精后6小时(hourspost-fertilization,6hpf)斑马鱼为模型,评价苍耳子水提取物的发育毒性;以正常发育受精后4天(dayspost-fertilization,4dpf)斑马鱼为模型,利用表型筛选、生理生化指标评价、油红O染色、吖啶橙染色和组织病理学等方法评价苍耳子水提取物对斑马鱼的肝毒性。结果:1.薄层色谱鉴别实验中,展开剂乙酸乙酯-甲醇-浓氨(25:1:0.2)能较好地将毛两面针素、氯化两面针碱和乙氧基白屈菜红碱实现分离,表明实验所用的薄层色谱法可对两面针的真伪进行有效鉴定。2.首次建立了两面针药材UPLC指纹图谱,并得到25个共有色谱峰,其中指认出氯化两面针碱、乙氧基白屈菜红碱和芝麻素3个色谱峰,相似度评价结果表明12批两面针药材的相似度为0.807～0.959;聚类分析和主成分分析结果表明12批两面针药材可分为两类,其中S1、S2、S4、S7和S9为一类,S3、S5、S6、S8、S10、S11和S12为一类。此外,伪品的色谱图与两面针指纹图谱的共有模式存在较大差异,表明所建立的指纹图谱方法能较好地区分两面针药材与其伪品。3.建立了UPLC同时测定两面针中氯化两面针碱、乙氧基白屈菜红碱和芝麻素含量的方法,并通过了方法学考察,结果氯化两面针碱、乙氧基白屈菜红碱和芝麻素的含量分别为1.2946～2.4975mg·g-1、0.8972～4.4132mg·g-1、0.2694～2.0540mg·g-1该方法可作为两面针中氯化两面针碱、乙氧基白屈菜红碱和芝麻素的含量测定方法。4.两面针发育毒性实验中,低浓度(≤50μg·L-1)两面针水提取物暴露处理的斑马鱼胚胎发育正常,与对照组无显著差异(P>0.05);而高浓度(≥100μg·mL-1)暴露处理时,引起斑马鱼胚胎发育畸形,包括头尾部发育迟缓、自主运动缺失、心率降低,黑色素减少、心包肿大、卵黄囊肿大等,甚至出现心跳停止或死亡。在一定浓度范围内,随着两面针水提取物浓度的增加,斑马鱼胚胎心率和孵化率不断降低,体长不断变短,畸形率和死亡率不断增加。5.苍耳子发育毒性实验中,40μg·mL-1苍耳子水提取物暴露处理的斑马鱼胚胎发育正常,与对照组无显著差异(P>0.05),280μg·mL-1苍耳子水提取物暴露能导致斑马鱼胚胎发育完全被抑制;苍耳子水提取物浓度为160μg·L-1时会显著降低48hpf斑马鱼胚胎的心跳次数(P<0.05),并在72hpf时出现心包水肿、卵黄囊吸收延迟等畸形发育。苍耳子肝毒性实验中,800μg·mL-1苍耳子水提取物暴露处理24h后斑马鱼肝脏面积显著增加(P<0.05),透明度降低,卵黄囊吸收延迟,部分鱼体肝脏轮廓不清晰;病理切片结果显示肝脏细胞出现空泡、细胞排列松散等现象;油红O染色结果显示肝脏区域出现明显的脂质累积;吖啶橙染色结果显示在肝脏区域存在细胞凋亡现象;此外,苍耳子水提取物暴露处理后显著降低斑马鱼体内超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性、升高丙氨酸转氨酶(alaninetransaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartatetransaminase,AST)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量(P<0.05)。而600μg·mL-1苍耳子水提取物暴露处理斑马鱼与对照组无显著差异(P>0.05)。综上,苍耳子可能通过氧化应激进而造成细胞凋亡来诱导斑马鱼肝毒性。结论:本课题建立了基于薄层色谱鉴别、UPLC指纹图谱结合多指标成分定量测定的两面针质量控制方法,为两面针质量控制提供更为全面、有效的评价方法,为提高两面针质量标准提供依据;毒性实验结果表