昆虫RNA病毒复制及昆虫抗病毒天然免疫机制研究

昆虫RNA病毒复制及昆虫抗病毒天然免疫机制研究昆虫RNA病毒是一类以昆虫为宿主并在其种群中进行传播的RNA病毒。这些病毒可以用于害虫的防治或益虫的保护工作。此外,由于这些病毒与许多脊椎动物病毒及植物病毒具有亲缘性并在形态学和生物化学上有相当大的相似性,昆虫RNA病毒正作为病毒学研究的重要实验模型而活跃在病毒学研究领域。野田村病毒科是一类重要的RNA病毒,它可以分为两个属(α野田村病毒属和p野田村病毒属),其中α野田村病毒属的病毒主要感染昆虫而β野田村病毒属的病毒主要感染鱼类。我们的研究主要围绕于武汉野田村病毒(Wuhannodavirus,WhNV)和弗洛克豪斯病毒(FlockHousevirus)展开,两者均隶属于α野田村病毒属,WhNV是由本实验室发现的中国首个野田村病毒,而FHV是野田村病毒中研究得最为清楚的病毒。野田村病毒的基因组由两条单链正义RNA(RNA1和RNA2)组成,其中RNA1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)ProtA,它是病毒复制复合体中的核心蛋白；RNA2则编码病毒的衣壳蛋白前体Protα。在病毒复制的过程中还会产生亚基因组RNA3,RNA3编码一种RNA干扰(RNAi)抑制子B2蛋白,能够使病毒有效逃逸宿主的RNAi抗病毒免疫。虽然关于野田村病毒科病毒复制机制的研究已经相当的深入和具体,但是仍有很多问题尚不清楚,例如野田村病毒是如何起始病毒RNA的复制的,ProtA是否具有其他的酶活性等。针对这些问题,我们运用本实验室分离获得的武汉野田村病毒(WuhanNodavirus,WhNV)为模型,系统的研究了WhNVRNA的复制起始机制及WhNVProtA的生化性质。我们发现,WhNVProtA能够在不依赖宿主或病毒其他蛋白的条件下以从头合成(denovo)机制起始病毒RNA的复制。另外,WhNVProtA还具有末端转移酶(terminalnucleotidyltransferase,TNTase)活性,这是首次在野田村病毒蛋白中发现该活性。通过进一步的研究,我们发现WhNVProtA的TNTase活性可以修复3’末端缺损的病毒RNA,这个机制可以被病毒运用从而确保病毒RNA复制的高效性和准确性。我们还研究了ProtA蛋白的RdRP活性和TNTase活性所需的RNA顺式作用元件,发现这两个活性所需的RNA顺式作用元件具有一定的区别,这表明这两种活性识别RNA的机制可能不同。此外我们还发现野田村病毒的ProtA具有解旋活性,能够使5’突出的双链RNA解旋,这种活性依赖于NTP和一些二价金属离子。这些工作对于了解其他野田村病毒或单链正义RNA病毒的复制机制有重要的借鉴意义。针对病毒在昆虫宿主中的复制,宿主能够采用多种抗病毒机制进行防御。由于昆虫缺乏适应性免疫,昆虫的防御机制基本依赖于天然免疫。昆虫的抗病毒天然免疫机制主要包括RNAi、Toll通路、Imd(immunedeficiency)通路、Jak-STAT通路和自噬等。先前的研究表明,在野田村病毒的复制过程中,能够激发宿主的RNAi通路,并且该通路能显著的抑制野田村病毒的复制。在我们和其他研究者的工作中都观察到RNAi通路的核心蛋白Dcr-2的敲降对于野田村病毒复制的影响程度显著高于另一核心蛋白AG02的影响,考虑到Dcr-2是一种RIG-I类似受体(RIG-I-likereceptor,RLR),这一不寻常的结果暗示Dcr-2可能以与RIG-I类似的方式参与到其他的信号通路中。我们运用另一种野田村病毒FlockHousevirus(FHV)和一种负链RNA虫媒病毒水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,VSV)进行研究,发现这两种病毒均能激发Toll通路,并且Toll通路的激发显著的受到Dcr-2的调控。进一步的研究表明,这种调控在革兰氏阳性菌或赖氨酸型肽聚糖激发的情况下也非常显著。我们进一步研究了Dcr-2对Toll通路调控的机制,发现Dcr-2能够直接结合于TollmRNA的3’-UTR区域,并促进TollmRNA的多聚腺苷酸化