小鼠胚胎成纤维细胞重编过程中p53、MDM2、Aurka基因相关性的实验研究

小鼠胚胎成纤维细胞重编过程中p53、MDM2、Aurka基因相关性的实验研究目的:研究携带有转录因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)的腺病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFc),通过诱导出诱导多能干细胞(iPSC),并分析在重编程过程中p53基因、MDM2基因、Aurka基因的变化规律,为提高诱导多能干细胞诱导效率提供思路。方法:1.对前期冻存的MEFc进行复苏,待MEFc生长良好后,加入带有4个转录因子(OSCK)的腺病毒,反复感染两次后,观察细胞形态结构变化;2.对诱导出的细胞进行多能性鉴定:通过对细胞形态学观察、成瘤性、碱性磷酸酶(偶氮偶联法)染色,及干细胞标志基因检测;3.将转染的细胞分别按照诱导前、诱导后24h、诱导后1w、诱导后2w四个时间段,利用Real-TimePCR技术,多次测量p53基因、MDM2基因、Aurka基因的转录情况。实验数据应用SPSS17.0软件进行统计学分析,各个基因内各个时间的数据采用单因素方差分析,统计学检验标准为P<0.05。结果:1.对诱导的细胞进行多能性鉴定:a、形态学变化:可观察到细胞边界轮廓清楚,胞体较小鼠成纤维细胞变大,变圆,长度变短,少数呈多变性,仍有明显突起,但突起长度变短。b、成瘤性观察:约7-8周后可见到大鼠根部明显2-3个畸胎瘤,用手触及包块质中等硬度,可滑动,与周围组织无粘连,表面光滑。取出包块组织,可见到包块淡红色块椭圆形柱状物,大小为约1cm×0.5cm×0.3cm。将取下的组织行切片、HE染色处理,可见细胞核成蓝色,胞质成粉红色,在中可见到大量杯状细胞组成的腺体组织、血管、大量的脂肪组织。c、碱性磷酸酶鉴定:可见大量碱性磷酸酶阳性颗粒。d、干细胞标志基因检测:Oct4、Sox2及Nanog在诱导的细胞中均有表达。2.在诱导过程中p53转录变化规律:1、转染前与转染后24h、转染后1w、转染后2w比较,相对表达量差异显著(P<0.05)。2、转染后24h与转染后1w及转染后两周比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。3.转染后1w与转染后两周比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。p53的转录在四因子腺病毒转染后24h既出现升高,在转染1w后较高,而在转染2w后出现下降。在诱导过程中MDM2转录变化规律:1、转染前与转染后24h、转染后1w、转染后2w比较,RQ差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。2、转染后24h与转染后1w及转染后两周比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。3、转染后1w与转染后两周比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。MDM2的转录在四因子腺病毒转染后24h出现下降,1w时下降明显,而在转染2w后却出现升高。与p53基因的变化规律成反比。在诱导过程中AURKA转录变化规律:1、转染前与转染后24h、转染后1w,RQ差异显著,具有统计学意义(P<0.05),与转染后2w比较,RQ差异不显著(P>0.05)。2、转染后24h与转染后1w及转染后2w比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。3、转染后1w与转染后2w比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。可认为Aurka的转录在四因子腺病毒转染后出现明显升高,1w时较转染后仍高,而在转染2w呈现与正常水平,且Aurka的转录升高水平明显高于p53基因。通过利用MDM2与Aurka的抑制剂发现细胞p53蛋白表达均明显升高。结论1.细胞的重编程过程能够激活p53信号通路,p53转录在转染2w后出现下降,考虑重编程已经完成,可考虑干预重编程过程的时间在2w内。2.细胞重编程过程中MDM2水平下降,通过利用MDM2拮抗剂在诱导多能干细胞中发现p53蛋白表达明显增加,可以通过对MDM2-p53信号通路的作用,影响诱