PDCD4介导病理性震荡剪切力对血管内皮细胞自噬和炎性小体的作用

PDCD4介导病理性震荡剪切力对血管内皮细胞自噬和炎性小体的作用研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管系统中最常见的疾病之一,其发病机制一直是研究的热点,陆续出现许多相关学说。近年来,临床研究提示动脉粥样硬化的多发区域存在共同的血流动力学特点,即血流剪切力改变。正常的生理层流剪切力对血管内皮细胞具有保护作用,促进扩血管活性物质的分泌,抑制动脉粥样硬化斑块的发生、发展;异常的病理剪切力增强血管内皮细胞的氧化应激和炎症反应,并促进缩血管活性物质和炎性介质的分泌,促进动脉粥样硬化斑块的发生、发展。20世纪90年代,一种新的凋亡相关基因,即程序性细胞死亡因子4(ProgrammedCellDeath4,PDCD4)由Shibahara等发现。随着研究的深入,发现PDCD4具有调节多种肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移的作用,并参与多种免疫性、代谢性和炎症性疾病的过程。既往研究发现PDCD4与心血管疾病关系密切,促进血管平滑肌细胞凋亡,抑制血管外膜成纤维细胞增殖,增加动脉粥样斑块不稳定性,加速动脉粥样硬化的发生和发展,但具体机制尚不清楚。自噬是一种古老的生物学现象,广泛存在于真核细胞中,也是一种新的程序性细胞死亡形式,通过降解细胞内的代谢废物并更新细胞器,来维持内环境平衡。研究发现自噬与心血管系统关系密切,自噬流的减弱与细胞衰老所致的心肌肥大、心功能降低有关。心肌细胞缺血诱导自噬增强,而增强细胞自噬则能够有效减轻再灌注所致损伤。细胞自噬和血流剪切应力,两者之间存在相互作用,直接或间接影响动脉粥样硬化发生和发展。但是,病理性震荡剪切力如何调节血管内皮细胞自噬,PDCD4是否参与这个过程尚不清楚。炎症反应参与动脉粥样硬化的发生发展多个过程。研究发现活化的NLRP3炎性小体能够显著增加巨噬细胞向泡沫细胞转化,最终导致动脉粥样硬化。病理性震荡剪切力是否影响血管内皮细胞炎性小体的表达,PDCD4是否参与该过程?这些问题尚需明了。目的1.观察病理性震荡剪切力对血管内皮细胞自噬和炎症小体的影响。2.观察PDCD4是否介导病理性震荡剪切力对血管内皮细胞自噬和炎症小体的作用。方法1.人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外提取和培养确保无菌条件,获取状态良好的长约15-30cm的新生儿脐带,使用己预热无菌生理盐水冲洗管腔,后注入己预热的胰酶消化液在室温下消化,吸出胰酶消化液并使用1XPBS溶液,反复冲洗。离心后,弃上清液,加入培养液,混匀细胞,将悬浮液移至无菌培养瓶中,置于培养箱中,24小时后更换培养液,每隔一天更换培养液。2.体外剪切力干预将I型鼠尾胶原均铺在高压灭菌的载玻片上,晾干后,体外培养良好的4-7代HUVECs均匀接种于玻片上,待细胞密度达90%,给予0、1、3、6、9、12、24小时的病理震荡剪切力(0±4dyne/cm2大小,频率为1Hz)刺激。观察病理性震荡剪切力对HUVECs中PDCD4表达的影响,并找到适宜的刺激时间,用于后续的实验研究。3.细胞转染细胞转染的PDCD4siRNA及阴性对照siRNA均购自上海吉玛基因生物科技有限公司,具体步骤按照Lipo2000试剂说明书,转染6-8小时后换液,并进行相应的实验刺激和检测。4.蛋白质印迹(WesternBlot)利用蛋白提取工作液提取蛋白,行SDS-PAG电泳、转膜、室温牛奶封闭、4℃一抗孵育、对应二抗孵育、化学显影,获得蛋白条带灰度值,统计学分析。5.实时荧光定量PCR(RT-PCR)TRIzol法提取HUVECs中总RNA。使用日本TaKaRa试剂盒进行逆转录反应,根据说明书制备反应体系。使用日本TaKaRa的SYBR试剂盒,根据说明书制备反应体系,行实时荧光定量PCR检测。6.统计学分析应用SPSS16.0软件对研究数据进行分析,平均值±标准误。非配对t检验用于两组间比较,多样本分析采用ANOVA单因素的方差分析方法,P<0.05认为存在显著的统计学差异。结果1.病理性震荡剪切力上调HUVECs中PDCD4的表达与静止对照组相比,病理性震荡剪切力干预下,随着时间的延长PDCD4的蛋白表达水平上调,力学干预6小时至24小时有统计学意义(P<0.05);病理性震荡剪切力干预6和9小时PDCD4mRNA表达上调有统计学意义(P<0.05),并在6小时到达峰值。提示病理性震荡剪切力可能在转录水平上调HUVECs中PDCD4mRNA,并促进HUVECs中PDCD4蛋白的表达。2.PDCD4参与调节血管内皮细胞的自噬在静止条件下,与阴性对照组相比,转染siRNA后沉默PDCD4,LC3BII/I、ATG5、freeATG12、conjATG12、P62表达下调(P<0.05),ATG3、ATG7、Beclin表达无明显变化。提示PDCD4参与血管内皮细胞自噬的部分过程的调节。3.病理性震荡剪切力参与调节血管内皮细胞的自噬与静止对照组相比,力学作用3、6、9小时LC3BII/I表达上调有统计学意义(P<0.05)(图3.A),且6小时到达峰值。给予病理性震荡剪切力刺激体外培养HUVECs6小时,通过WesternBlot检测HUVECs中自噬相关分子蛋白表达。实验结果显示:在阴性对照组中,与静止对照相比,病理性震荡剪切力促进ATG5、freeATG12、conjATG12、ATG3、ATG7、P62蛋白的表达(P<0.05),对Beclin表达无明显影响。提示病理性震荡剪切力参与血管内皮细胞自噬的调节。4.PDCD4参与病理性震荡剪切力对血管内皮细胞自噬的调节与阴性对照组相比,沉默PDCD4,能够阻断病理性震荡剪切力对LC3BII/I、ATG5、freeATG12、conjATG12、P62的促进(P<0.05),但对ATG3、ATG7、Beclin的表达无明显影响(P<0.05)。提示PDCD4参与病理性震荡剪切力对血管内皮细胞自噬调节的部分过程。5.PDCD4参与血管内皮细胞炎性小体的调节在静止条件下,与阴性对照组相比,沉默PDCD4,NLRP3、ASC的mRNA和蛋白均表达下调(P<0.05)。提示PDCD4参与血管内皮细胞炎性小体的调节。6.病理性震荡剪切力参与血管内皮细胞炎性小体的调节在阴性对照组细胞中,和静止对照组相比,病理性震荡剪切力促进NLRP3、ASCmRNA和蛋白的表达(P<0.05)。提示病理性震荡剪切力促进血管内皮细胞炎性小体表达。7.PDCD4参与病理性震荡剪切力对血管内皮细胞炎性小体的调节与阴性对照组相比,沉默PD