“通督启神”针法对SAMP8小鼠海马CBF的影响及PLA-2-AA通路机制研究

“通督启神”针法对SAMP8小鼠海马CBF的影响及PLA_2-AA通路机制研究目的本项研究旨在深入探讨“通督启神”针法对SAMP8小鼠空间学习与记忆能力的影响及其作用特点,初步阐明“通督启神”针法对SAMP8小鼠海马脑血流量(CBF)的调节效应及其星形胶质细胞磷脂酶A2(PLA2)-花生四烯酸(AA)通路机制,为针刺干预阿尔茨海默病(AD)提供活体客观显像证据支撑,进一步深化与拓展针刺干预AD有关机制研究,揭示“通督启神”针法的科学内涵。方法8月龄SAMP8雄性小鼠66只,随机分为老年痴呆组(AD)、针刺组(A)及药物组(M),每组22只;以同龄SAMR1雄性小鼠22只为正常组(N)。N组在相同饲养条件下不做任何处理,仅在他组进行干预时抓取一次,并用自制鼠套束缚。20min/次,1次/天,共计26天。AD组干预方法同N组。A组小鼠采用自制鼠套固定后,选用百会穴及印堂穴进行针刺干预。上述两穴均向上平刺进针,进针深度为0.3cm,针刺过程中每隔5min行90°小幅度捻转15s,捻转速度180°/s。20min/次,1次/天,共计26天。M组小鼠采用盐酸多奈哌齐灌胃,剂量为0.65μg/g,1次/天,共计26天,其余同N组。各组于实验第16天随机选取10只小鼠进行Morris水迷宫检测,行为学检测与上述干预同步进行,依次进行可视平台实验、隐蔽平台实验、空间探索实验及反向实验,共计11天。行为学检测结束后,上述各组于实验第27天随机选取6只小鼠进行功能性磁共振成像(fMRI)检测,采用动脉自旋标记(ASL)模块重建脑血流图像,手动选取双侧海马、前额皮层为兴趣区域,计算双侧海马及前额皮层的平均CBF值。fMRI检测结束后,上述各组小鼠于实验第28天腹腔麻醉安乐死取脑,采用苏木精-伊红(HE)染色法观察海马区微血管,分析与记录微血管内径、外径与数目,计算内外径比值与微血管密度。末次干预结束24h后,各组于实验第27天随机选取6只小鼠灌流取脑,采用免疫荧光(IF)染色技术观察海马GFAP与PLA2、环氧化酶-1(COX-1)及细胞色素P450酶2C23(CYP2C23);α-平滑肌肌动蛋白与细胞色素P450酶4A(CYP4A)的共表达情况。采用ImageJ软件进行荧光光密度分析,计算星形胶质细胞胞内PLA2、COX-1、CYP2C23及血管平滑肌细胞胞内CYP4A蛋白的平均荧光光密度值。末次干预结束24h后,各组于实验第27天随机选取6只小鼠腹腔麻醉安乐死取海马,采用蛋白免疫印迹(WB)技术观察海马PLA2、COX-1、CYP2C23及CYP4A表达情况,计算相关蛋白的相对表达量;采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术检测海马AA、前列腺素E2(PGE2)及表氧二十碳三烯酸(EETs)水平。结果1.Morris水迷宫结果显示,各组小鼠可视平台实验逃避潜伏期及游泳速度组间比较均未见显著差异。AD组逃避潜伏期分别于隐蔽平台实验第2-5天及反向实验全程显著高于N组(p<0.01);A组及M组逃避潜伏期分别于隐蔽平台实验第2-5天及第4-5天、反向实验第1-4天及第2-4天较之AD组显著降低(p<0.01),A组隐蔽平台实验第4天及反向实验第3天、M组隐蔽平台实验第2-5天及反向实验全程逃避潜伏期均显著高于N组(p<0.01或p<0.05);隐蔽平台及反向实验各时间点各组小鼠游泳速度组间比较未见显著差异。AD组空间探索实验穿台次数、目标象限游泳时间比及路程比均显著低于N组(p<0.01),入水象限游泳时间比及路程比则较之显著升高(p<0.01)。A组及M组穿台次数较之AD组均显著提升(p<0.01或p<0.05),但仍低于N组(p<0.01);目标象限游泳时间比及路程比较之AD组均显著提升(p<0.01或p<0.05),入水象限游泳时间比及路程比则均显著降低(p<0.01);各组小鼠空间探索实验游速未见显著差异。2.fMRI结果显示,AD组小鼠双侧前额皮层及海马CBF均显著低于N组(p<0.01)。A组及M组小鼠双侧前额皮层及海马CBF较之AD组均存在升高趋势,除A组右侧前额皮层外均具有统计学差异(p<0.01或p<0.05),但仍均显著低于N组(p<0.01)。3.HE染色结果显示,AD组、A组及M组海马微血管内径、外径及内外径比值均显著低于N组(p<0.01或p<0.05)。A组海马微血管内径显著低于AD及M组(p<0.05),外径则显著低于AD组(p<0.05)。4.IF结果显示,AD组与GFAP存在共表达的PLA2、COX-1及CYP2C23的平均光密度较之N组均显著升高(p<0.01),与α-平滑肌肌动蛋白存在共表达的CYP4A的平均光密度则显著降低(p<0.01)。较之AD组,A组与M组与GFAP存在共表达的PLA2、COX-1及CYP2C23的平均光密度均显著降低(p<0.01),但仍显著高于N组(p<0.01或p<0.05);CYP4A的平均光密度均显著升高(p<0.01或p<0.05)。5.WB结果显示,AD组海马PLA2、COX-1及CYP2C23相对表达量均显著高于N组(p<0.01或p<0.05),CYP4A相对表达量则显著降低(p<0.01)。较之AD组,A组及M组PLA2、COX-1及CYP2C23相对表达量均显著降低(p<0.01或p<0.05),其中PLA2相对表达量仍高于N组(p<0.05);CYP4A相对表达量则显著增加(p<0.05),但仍低于N组(p<0.05)。6.UPLC-MS/MS结果显示,AD组海马AA、PGE2、5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET及14,15-EET含量较之N组均显著提升(p<0.01或p<0.05)。A组AA、PGE2、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET含量及M组AA、PGE2、8,9-EET、11,12-EET含量均显著低于AD组(p<0.01或p<0.05),A组PGE2、5,6-EET、8,9-EET含量及M组PGE2、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET含量均显著高于N组(p<0.01或p<0.05)。结论1.“通督启神”针法能够明显改善8月龄SAMP8小鼠的空间学习与记忆能力,且作用与多奈哌齐相当。在对空间学习能力的良性调节上,“通督启神”针法较之多奈哌齐具有一定的疗效优势,具有高效的作用特点。2.“通督启神”针法能够显著提升8月龄SAMP8小鼠海马及前额皮层CBF,且作用与多奈哌齐相当。良性调节认知相关脑区灌注,防止神经元损伤可能是针刺干预改善认知功能损害的重要机制之一。3.“通督启神”针法能够有效抑制8月龄SAMP8小鼠海马星形胶质