粪生链霉菌HLF-43的代谢功能改造与突变株新产抗肿瘤活性产物研究

粪生链霉菌HLF-43的代谢功能改造与突变株新产抗肿瘤活性产物研究多年来,放线菌在新药开发资源中一直占据着非常的重要地位。然而大多数从自然界中分离得到的放线菌菌株在现有活性筛选模型下未能表现出活性,因此,如何改造无活性放线菌的代谢功能而使其最终成为活性化合物产生菌是极具深远意义的课题。核糖体工程是一种利用抗生素抗性筛选方法获取高产突变株的有效方法,它采用传统的抗性筛选方法即使在菌株遗传信息不明确的条件下仍然能够获得高产突变株,但该筛选方法是以自发突变为基础的,而自发突变的低突变率不可避免地造成了研究工作中时间和资源的浪费,因此,本文在活性化转化无活性放线菌与提高菌株突变率的双重需求下,相继建立了微波诱变结合新霉素抗性筛选、磁性纳米粒子辅助微波诱变结合新霉素抗性筛选、磁性纳米粒子辅助微波诱变结合混合抗生素抗性筛选等三种可用于无活性放线菌活性化转化的实验技术新方法。将以上三种方法分别运用于无活性粪生链霉菌野生株HLF-43（1000μg/mL样品对K562细胞的抑制率为3.9%）,成功获取了多株突变株,并通过突变株发酵产物对K562细胞的增殖抑制活性测试,最终取得多株活性突变株。通过比较研究以上三种方法分别获得的三株活性突变株发酵产物的新产抗肿瘤活性主产物,初步探讨了主活性代谢产物与突变株中可能被激活的代谢途径之间的关系,并在随后研究中对突变株N73进行了较为系统的新产活性产物研究。1.微波诱变结合新霉素抗性筛选改造粪生链霉菌HLF-43代谢功能的研究以粪生链霉菌HLF-43为出发菌,通过微波诱变结合新霉素抗性筛选,得到新霉素抗性突变株共128株,其中微波诱变新霉素抗性株117株、自发突变抗性株11株。活性测试结果表明,8株微波诱变抗性突变株对K562细胞有一定抑制作用,100μg/mL发酵样品对K562细胞的抑制率大于20%。经对不同微波辐照时间和不同浓度新霉素组合筛选实验结果的比较分析,初步确定对HLF-43的微波辐照诱变最佳时间为120s。2.用磁性纳米粒辅助微波诱变新方法改造粪生链霉菌HLF-43代谢功能的研究首次探索了用Fe₃O₄磁性纳米粒辅助微波诱变来改造无活性放线菌代谢功能的新方法,以海洋来源无活性粪生链霉菌野生株HLF-43为出发菌,对其孢子悬液在Fe₃O₄磁性纳米粒子存在下进行微波辐照诱变,经抗性筛选获得新霉素抗性突变株,并经抗肿瘤活性筛选最终获得活性突变株。利用该方法获得了新霉素抗性突变株共80株,其中28株发酵样品对K562细胞有抑制活性,100μg/mL浓度下的抑制率大于20%,活性突变株获取率达35%（28/80）,所获活性突变株的遗传性状也较稳定。在与不加Fe₃O₄磁性纳米粒子的微波辐照结合新霉素抗性筛选实验相比,该方法更有利于筛选获得高浓度新霉素抗性突变株,同时活性突变株获得率也有大幅度提高,活性突变株的遗传性状也获改进。3.微波诱变结合混合抗生素抗性筛选改造粪生链霉菌HLF-43代谢功能的研究为进一步改善筛选效果,本论文还尝试建立了多种抗生素混合后同时进行抗性筛选新方法,即在Fe₃O₄磁性纳米粒辅助微波诱变的基础上,采用新霉素、卡那霉素、庆大霉素和利福平四种抗生素同时进行混合抗性筛选处理原始株HLF-43,获取了混合抗生素抗性突变株共16株,其中7株微波诱变突变株样品显示出了明显抗肿瘤活性,其发酵样品在100μg/mL浓度下对K562细胞的抑制率大于20%,活性突变株获取率达43.7%（7/16）。与前期实验方法相比,本方法在活性突变株的获取率上有了进一步的提高。4.三种不同方法所得突变株N27,36和15G的新产活性主产物分离及比较为考查三种改造放线菌代谢功能方法可能对菌株产物的影响,以原始株HLF-43通过三种不同的处理方式所到的活性突变株N27（磁性纳米辅助微波诱变结合新霉素筛选）,36（微波诱变结合新霉素筛选）,15G（磁性纳米辅助微波诱变结合多种抗生素混合筛选）为目标菌株进行快速产物研究,根据菌株各自时效考察结果,确定了其最佳发酵时间并对突变株进行大量发酵和样品制备。运用活性追踪为主的快速分离思路,分离鉴定了突变株代谢产物中与原始菌相比有差异的三个化合物（1-3）。化合物1（14-甲基十五烷酸）从所有三株突变株中都分离得到,同时它也代表着各突变株的主活性;另从突变株36中分离得到化合物2（14-甲基十五烷酸单甘油酯）,为化合物1的衍生物;从突变株15G中分离得到化合物3（β-谷甾醇）,为常见的甾醇类化合物。化合物1-3在样品浓度为100μg/mL时对K562细胞的增殖抑制率分别为58.1%,74.5%和25%,其中化合物1,2的IC₅₀分别为95μg/mL和52.5μg/mL且其对K562细胞的活性为首次报道。化合物结构见表1。经文献调研和研究结果说明,前述三种菌株处理方法均使原始菌HLF-43的代谢功能发生了改变,这些改变可能导致突变株中乙酰辅酶A的羧化酶等微生物脂肪酸生物合成酶的高表达而造成脂肪酸大量合成（在N27株可分离得到超过350mg的化合物1）。而这些代谢功能的改变可能源于突变株获得抗性的同时在其核糖体上发生的相关突变。5.突变株N73的新产活性产物的研究以初筛活性最好的突变株N73为目标菌株进行产物研究,根据时效考察结果,确定了其最佳发酵时间为13d。运用活性追踪与原始株对照的分离模式,分离鉴定了突变株代谢产物中与原始菌相比有差异的7个化合物,其中3个脂肪酸甘油脂类化合物14-甲基十五烷酸单甘油酯（2）、月桂酸单甘油酯（4）和顺式十八碳-9-烯酸单甘油酯（5）;2个二酮哌嗪类化合物环-（4-羟基-脯氨酸-亮氨酸）（6）和环（4-羟基-脯氨酸-苯丙氨酸）（7）;1个甾体类化合物胡萝卜苷（8）和1个黄酮类化合物染料木素（9）。文献调研结果显示,除化合物6,9为本课题组报道外,其他化合物在粪生链霉菌的代谢产物研究中均未见报道。此外,将单体化合物与原始株发酵样品进行HPLC比对证实了它们为原始株不生产而突变株新产的活性化合物。将单体化合物进行抗肿瘤活性测试,这些化合物均显示出对K562细胞的增殖抑制活性。化合物4,5在样品浓度为100μg/mL时对K562细胞的增殖抑制率分别为84.4%、55.5%,其IC₅₀分别为57.7和82.9μg/mL;化合物6-9对K562细胞抑制率分别为33.2%,21.0%,33.3%,41.3%。其中化合物4、5、7、8对K562细胞的增殖抑制活性未见报道。上述研究结果进一步说明Fe₃O₄纳米粒辅助微波诱变与新霉素抗性筛选组合方法改造了无活性放线菌HLF-43的代谢功能。综上,本论文以从潮间带海泥样品中分离得到无活性粪生链霉菌野生株HLF-43为原始株,采用微波诱变结合新霉素抗性筛选,磁性纳米粒子辅助下的微波诱变结合新霉素抗性筛选以及磁性纳米粒子辅助下的微波诱变结合混合抗生素抗性筛选等三种实验技术新方法,分别获取抗性突变株117,80,16株,对其进行发酵培养与活性筛选,得到在100μg/mL样品浓度下对K562细胞的抑制率大于20%的抗肿瘤活性突变株8,28,7株,活性率分别为6.8%（8/117）,35.0%（28/80）,43.7%（7/18）,表明三种方法均能有效改造HLF-43的代谢功能。通过比较研究以上三种不同方法获得的三株活性突变株发酵产物中新产抗肿瘤活性主产物,初步推测主活性代谢产物脂肪酸类化合物的大量合成可能与突变株获得抗性时核糖体上发生的相关突变有关。在随后对