核桃壳中黄嘌呤氧化酶抑制活性物质的分离鉴定及构效关系的研究

核桃壳中黄嘌呤氧化酶抑制活性物质的分离鉴定及构效关系的研究高尿酸血症是人类常见的代谢疾病,会导致关节和肾脏形成尿酸盐结晶,同时会增加患痛风性关节炎、尿酸肾石病、心血管疾病和高血压等的风险。黄嘌呤氧化酶是嘌呤代谢的关键酶,该酶可以催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤,进而将黄嘌呤转化为尿酸,与高尿酸血症的形成息息相关。因而服用黄嘌呤氧化酶抑制剂是治疗高尿酸血症的非常有效的方法之一。但是,目前广泛使用的临床药物别嘌呤醇会导致一系列副作用,例如过敏反应、Steven-Johnson症状和肾脏毒性等,因此治疗高尿酸血症需要更加安全有效的黄嘌呤氧化酶抑制剂。文献报道表明植物中的天然活性物质既是潜在的黄嘌呤氧化酶抑制剂,同时又是良好的抗氧化剂。核桃属于胡桃科胡桃属植物,广泛的分布于世界各地,核桃壳质量约占核桃质量的30%,核桃加工后会产生大量的核桃壳。本论文研究了核桃壳的提取物的体内降尿酸活性,并期望从中寻找出新型的黄嘌呤氧化酶抑制剂,现将主要研究结果归纳如下:(1)优化了评定样品黄嘌呤氧化酶抑制活性的催化反应条件,将测定酚类物质的黄嘌呤氧化酶抑制活性的高效液相色谱法和分光光度法进行了对比研究。优化后的催化反应条件为:底物浓度0.24mM、酶浓度0.01U/mL、催化反应温度25oC、pH值7.5、催化反应时间30min和终止反应用HCl溶液(1.0M)的体积80μL。两种方法在尿酸的检测浓度范围内都具有较好的线性关系和较高的日内精密度,但高效液相色谱法的检出限和定量限比分光光度法大约低了一个数量级,灵敏度较高。分光光度法在检测活性较弱的物质或在292nm处有强吸收的酚类物质的黄嘌呤氧化酶抑制活性时结果会偏高。相比之下测定黄嘌呤氧化酶抑制活性的高效液相色谱法消除了干扰,并可以在不控温的情况下21h内检测有效,每个样品检测只需8min,可用于样品的高通量筛选。同时高效液相法的日间精密度在0.10-1.50%的范围内,说明该法具有较高的日间精密度。(2)为了从核桃果实及其副产物中筛选出合适的原料,对核桃果实(青皮、壳和仁)、茎和叶提取物的抗氧化活性和黄嘌呤氧化酶抑制活性进行了对比研究。核桃壳提取率较低(提取率为2.80%),但其提取物的总酚含量(14.81±0.50GAEg/100g,GAE没食子酸当量)最高,抗氧化活性(ORAC3423.44±142.52μmolTE/g,TE为Trolox当量,还原力115.86±2.05μg/mL)最优,黄嘌呤氧化酶抑制活性仅次于核桃青皮提取物(核桃壳和青皮提取物抑制黄嘌呤氧化酶的半数抑制浓度分别为988.36±31.31μg/mL和616.86±17.84μg/mL),在保健食品工业中具有潜在的应用价值。同时,通过高效液相分析谱图发现核桃果实不同部分(青皮、壳和脱脂核桃仁)、茎和叶提取物组成存在着一定的差异,但均具有相同的特征峰,说明这些样品的主要成分比较接近。(3)探讨了核桃壳提取物在高尿酸大鼠体内的降尿酸活性,并在体外进行了以黄嘌呤氧化酶抑制活性为导向的分离、纯化和结构鉴定。按照166mg/kg核桃壳提取物的剂量灌胃大鼠30d,发现灌胃核桃壳提取物不会影响大鼠的体重;灌胃20d时该组大鼠的血尿酸含量明显低于模型组大鼠(核桃壳提取物组vs模型组,p<0.05),在30d时血尿酸含量降低到模型组的76.41%(核桃壳提取物组vs模型组,p<0.05),同时大鼠血清中的尿素氮和肌酐含量(核桃壳提取物组vs模型组;尿素氮p<0.01,肌酐p<0.05)明显降低,说明核桃壳提取物具有体内降尿酸活性和肾脏保护作用。以黄嘌呤氧化酶抑制活性为导向进行分离纯化,鉴定出了对香豆醛、β-D-胡萝卜苷、对羟基苯甲醛和氢化胡桃醌这四种物质。其中对香豆醛的黄嘌呤氧化酶抑制活性最强,为混合性抑制剂,与别嘌呤醇具有协同增效作用。核桃壳提取物和对香豆醛可以作为预防和治疗高尿酸血症及痛风的活性物质。(4)基于对香豆醛及其结构类似物,探讨了黄嘌呤氧化酶抑制活性的构效关系,并对对香豆醛抑制黄嘌呤氧化酶的机制进行了探讨。体外的黄嘌呤氧化酶抑制活性和分子对接结果表明对香豆醛的醛基、双键和羟基对其黄嘌呤氧化酶抑制活性具有重要贡献。对香豆醛与黄嘌呤氧化酶之间相互作用主要包括对香豆醛与苯丙氨酸-914和苯丙氨酸-1009之间的苯环与苯环的相互作用,羟基与谷氨酸-1261和精氨酸-880之间的两个氢键,醛基与苏氨酸-1010和缬氨酸-1011之间的两个氢键。通过改变对香豆醛本身基团的位置和增加基团进一步探讨了对香豆醛及其衍生物抑制黄嘌呤氧化酶的构效关系,结果表明在对香豆