第四章食品中的细菌及其检测

第四章食品中细菌及其大肠菌群的检测食品中细菌菌落总数的测定食品中大肠菌群的测定3/24/20241华南农业大学食品学院王丽第一节食品中菌落总数的测定3/24/20242华南农业大学食品学院王丽一、菌落总数GB/T4789.2-2010:食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得每ml（或每g）检样中形成的微生物菌落总数。本标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。

3/24/20243华南农业大学食品学院王丽二、菌落总数测定的意义1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2、预测食品存用的期限长短。3、了解细菌在食品中的繁殖动态。3/24/20244华南农业大学食品学院王丽三、菌落总数测定的方法※平板倾注法※平板表面涂布法3/24/20245华南农业大学食品学院王丽四、平板倾注法测定菌落总数检验步骤(程序)：

检样→稀释处理→做平板→培养→菌落计数→报告结果3/24/20246华南农业大学食品学院王丽（一）、样品稀释及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入营养琼脂15~20ml25g样品生理盐水3/24/20247华南农业大学食品学院王丽

注意：检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min。

3/24/20248华南农业大学食品学院王丽对照空白对照：不加样品，反映培养基中的杂质及污染情况稀释液对照：加1mL无菌稀释液，反映稀释液是否受到污染无菌操作对照：在空气中暴露30min，反映空气质量和操作技术3/24/20249华南农业大学食品学院王丽（二）培养普通食品:37℃48h，倒置放平板水产品:30℃48h3/24/202410华南农业大学食品学院王丽（三）计数和报告

到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。3/24/202411华南农业大学食品学院王丽1、菌落的选择（1）单个菌做一个菌落计（2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。3/24/202412华南农业大学食品学院王丽2、平板菌落计数的选择

选取菌落数在30～300之间的平板。（1）、若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内：计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数，做为每克（毫升）的菌落总数结果。3/24/202413华南农业大学食品学院王丽2、平板菌落计数的选择2）若有两个连续稀释度的平板菌落在适宜范围：

N=∑C/(n1+n2)d

式中，

N－样品中菌落数∑C－平板菌落数之和

n1－第一个适宜稀释度平板数

n2－第二个适宜稀释度平板数

d－稀释因子（第一稀释度）3/24/202414华南农业大学食品学院王丽稀释度1：100（第一稀释度）1：1000（第二稀释度）菌落数232，24433，35例：

N=∑C/(n1+n2)d

＝（232＋244＋33＋35）/[2+(0.1×2)]×10-2

＝544/2.2×10-2

＝24772=250003/24/202415华南农业大学食品学院王丽

3）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告

4）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告

5）如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30～300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告

6）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。

3/24/202416华南农业大学食品学院王丽3/24/202417华南农业大学食品学院王丽3、菌落数的报告1）菌落数在1～100时，按“四舍五入”原则，采取两位有效数字；2）如大于或等于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算；3）所有平板蔓延菌落无法计数，报告菌落蔓延；4）所有空白对照菌落生长，则检测结果无效；5）固体检样以克（g)为单位报告，6）液体检样以毫升（ml）为单位报告，7）表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。

3/24/202418华南农业大学食品学院王丽五、菌落总数Petrifilm测试片法3/24/202419华南农业大学食品学院王丽复习题1、什么是菌落总数？2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。4、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？3/24/202420华南农业大学食品学院王丽第二节食品中大肠菌群的检验3/24/202421华南农业大学食品学院王丽一、大肠菌群

1、

什么是大肠菌群？

在一定条件下（36℃条件下培养48h）能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。（GB/T4789.3-2010）2、大肠菌群的组成:

大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。3/24/202422华南农业大学食品学院王丽属代表种致病性埃希氏菌属（Escherichia）大肠埃希氏菌(E.coli)肠道外感染，急性腹泻志贺氏菌属（Shigella）痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)细菌性痢疾爱德华氏菌属（Edwardsiella）迟纯爱德华氏菌(E.tarda)蛇类等血动物的正常肠道寄居菌，偶见于健康人或腹泻者粪便内沙门氏菌属（Salmonella）伤寒沙门氏菌(S.typhi)肠热症、急性肠炎、败血症枸橼酸杆菌属(Citrobacter)弗劳地氏枸橼酸杆菌(C.freundii)条件致病菌，引起继发性感染克雷伯氏菌属(Klebsiella)肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)肺炎，泌尿系、创伤感染败血症等阴沟肠杆菌(Enterobacter)产气杆菌(E.aerogenes)很少引起原发性感染哈夫尼亚菌属(Hafnia)蜂窝啥夫尼亚菌(H.alvei)对人无致病性沙雷氏菌属(Serrati)粘质沙雷氏菌(S.marcescens)条件致病菌，引起泌尿系，呼吸道及创伤感染变形杆菌属(Proteus)普通变形杆菌(P.vulgaris)食物中毒，泌尿系、呼吸道感染等耶尔森氏菌属(Yersinia)鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)鼠疫欧文氏菌属(Erwinia)草原居民欧文氏菌(E.herbicola)植物寄生菌，曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到3/24/202423华南农业大学食品学院王丽1、粪便污染的指标菌：大肠菌群二、大肠菌群的测定意义3/24/202424华南农业大学食品学院王丽2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因在粪便中数量最大；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；检测方法简便容易。3/24/202425华南农业大学食品学院王丽3、大肠菌群的测定意义（1）判断食品中否受到粪便污染。（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。3/24/202426华南农业大学食品学院王丽三、大肠菌群的生物学特性1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气

3.培养特性：

在ＥＭＢ琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；

在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。3/24/202427华南农业大学食品学院王丽EMB平板照片3/24/202428华南农业大学食品学院王丽麦康凯琼脂平板Ageofcultureis24h3/24/202429华南农业大学食品学院王丽４、大肠菌群数量的表示方法

1）大肠菌群MPN大肠菌群MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值；

2）大肠菌群值大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。故大肠菌群值越大，表示食品中所含的大肠菌群细菌的数量越少，食品的卫生质量也就越好：在这两种表示方法中，目前国内外普遍采用大肠菌群MPN，而大肠菌群值逐渐趋于不用。3/24/202430华南农业大学食品学院王丽四、大肠菌群检验方法及操作方法国家标准：3/24/202431华南农业大学食品学院王丽检样稀释处理BGLG肉汤产气大肠菌群阴性不产气接种LST肉汤管不产气产气大肠菌群阳性查ＭＰＮ表报告结果3/24/202432华南农业大学食品学院王丽1:1001:10各加入1ml各加入1ml各加入1mlＬＳＴ发酵管ＬＳＴ发酵管ＬＳＴ发酵管初发酵检样稀释检样量1g/ml检样量0.1g/ml检样量0.01g/ml证实试验ＢＧＬＢ发酵管查MPN表报告结果3/24/202433MPN法简介TheMostProbableNumberMethod3/24/202434华南农业大学食品学院王丽1g/ml检样中最近似值(MPN)表以1、0.1、0.01、各用3管。阳性管数MPN个/100g/ml1g/ml×30.1g/ml×30.01g/ml×3000＜30

0013000260003900103001160012900131200206002190022120023150030900311300321600331903/24/202435六、大肠菌群快速检验食品大肠菌群快速检验方法：TTC显色法DC试管法纸片法3/24/202436华南农业大学食品学院王丽（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片

使用方法：1.样品稀释同国标法2.接种：饮料和饮用水采用原液、1:10、1:100三个稀释度，固体食品采用1:1、1:10和1:100三个稀释度。用1亳升灭菌吸管吸取1亳升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。3/24/202437华南农业大学食品学院王丽3.培养：将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在36℃下培养15－24h观察结果。4.结果判定:纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者,为阳性.纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性.纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性.酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色斑点为阴性3/24/202438华南农业大学食品学院王丽（二）餐具大肠菌群快速检验(纸片法)使用方法：1.

采样6—10份。碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，30秒后取下，置于原塑料袋内。筷子以5只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内。3/24/202439华南农业大学食品学院王丽2.将已采样的纸样置于37°C培养15小时.纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格。3/24/202440华南农业大学食品学院王丽食品冷饮大肠菌群检验纸片

冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定3/24/202441华南农业大学食品学院