马铃薯脱毒组培苗繁育技术规程

1马铃薯脱毒组培苗繁育技术规程2规范性引用文件GB/T29375—2012马铃薯脱毒试管苗GB/T29378—2012马铃薯脱毒种NY/T401—2000脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术3术语和定义3.1应用茎尖分生组织培养技术，脱去主要危害马铃薯3.23.3芽顶端部分（0.1mm～10mm）其中包括分生组织（0.05mm～0.13.43.523.63.73.8应用茎尖分生组织培养技术获得的，经检测确认不带马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃等病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVD）、不带任何细菌和真菌，经试种观察具有原3.94组培室的要求4.1组培室布局3图1组培室各功能间布局平面示意图4.2设施、设备及药品4.2.1生产组培苗的设施、设备见附录A。4.2.2生产组培苗的试剂见附录B。4.3培养基配方4.3.1无菌苗培养基配方见附录C。4.3.2茎尖培养基配方见附录D。4.3.3脱毒苗扩繁培养基配方见附录E。4.3.4核心苗保存培养基配方见附录F。4.4卫生要求4.4.1基本要求。组培室各功能间应保持干净、整洁，每周用0.1%的优氯净擦拭工作台面、窗台及拖地面。4.4.2接种室。应定期使用0.25%～1%新吉尔灭擦拭窗台、小推车等，用0.1%的优氯净擦拭地面，隔天开启紫外灯，每次40min～60min。4.4.3培养室。应定期使用0.25%～1%新吉尔灭擦拭培养架和窗台，用0.1%的优氯净擦拭地面。每周开紫外灯1次～2次，每次40min～60min。4.4.4超净工作台。每次使用前，应提前打开风机和紫外灯30min。接种时关闭紫外灯，用75%酒精擦拭工作台面及内壁。每周1次～2次用0.25%～1%新吉尔灭擦拭超净工作台的外表面。4.4.5接种工具。每台超净工作台应备两套接种工具轮流使用。接种前对使用的镊子、剪刀、解剖刀等工具进行灼烧或插入高温灭菌器中灭菌，冷却后使用。4.4.6接种操作人员。进入接种室前，用肥皂或洗手液洗净双手，换上消毒工作服，戴好口罩。操作过程中，每转接完一瓶基础母瓶后用75%的酒精清擦手和工作台面。4.4.7消毒。全自然光培养室门口缓冲间地面消毒槽内应放入消毒剂，工作人员进入时应对鞋底消毒。4.4.8污染瓶苗的处理。组培苗培养期间，经常观察组培苗的状况，发现污染应及时清除，污染瓶苗经高压灭菌后再倒弃。45脱毒材料的选取5.1植株初选5.2材料选择5.2.1选用植株进行培养时，应选取健康且具备品种典型性状植株的顶芽、腋芽或茎段作为外植体材料。5.2.2选用薯块芽进行培养时，在生育后期到收获期，应在已做标记的植株中进行薯块复选。选择高产、大薯率高、无病斑、无虫蛀、无机械损伤，且皮色、肉色、薯形、芽眼等性状符合品种特征的健康薯，清洗泥土后催芽，作为外植体材料。5.3类病毒筛查入选的植株或块茎，按照NY/T401—2000中附录B给出的方法检测马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd），筛选无马铃薯纺锤块茎类病毒（PS6脱毒与培养6.1外植体材料预处理6.1.1植株处理将从田间选择的植株移栽至温室无菌盆土中生长一段时间，定期喷洒6.1.2块茎催芽和病毒钝化6.1.2.1块茎自然出芽：入选的块茎经清洗、消毒后放置于室内常温下自然萌发，待芽长至2cm～3cm即可用于无菌苗的培养。对含有S病毒、X病毒的块茎需置于37℃±1℃培养箱中处理3周～4周，钝化病毒。6.1.2.2人工方法催芽：入选的块茎经清洗后用0.1%硫脲+5mg/L赤霉素溶液浸泡5min，取出晾干后，用0.1%多菌灵溶液浸泡30min或75%酒精喷湿进行表面消毒，置于25℃黑暗条件下催芽，待芽长至2cm～3cm即可用于无菌苗的培养。对含有S病毒、X病毒的块茎需置于37℃±1℃培养箱中处理3周～4周，钝化病毒。6.2无菌苗培养基的制备6.2.1无菌苗培养基可用MS培养基或加激素的MS培养基，配方参见附录B和附录C。6.2.2将制备好的培养基分装于培养容器中，盖好盖子。6.2.3将制备好的培养基在高压蒸汽灭菌锅压力为1.1kg/cm2、温度为121℃条件下灭菌25min～30min，冷却后在洁净贮存室放置3d～5d备用。6.3外植体消毒6.3.1取材：从处理过的块茎上取2cm～3cm长的顶芽和侧芽，或取优选植株的顶芽、腋芽或茎段作为外植体材料。5清洗：在流水下6.3.2用软毛刷轻轻逐个刷洗外植体后放于烧杯中，用纱布封口，用自来水冲洗10min～20min。6.3.3消毒：在超净工作台上，先用75%的酒精浸15s，无菌水冲洗2次，再用0.1%的升汞浸泡8min~10min（或用5%次氯酸钠浸泡15min～20min），无菌水漂洗5次～8次。6.4离体培养无菌苗6.4.1接种和培养：在超净工作台上，对经严格消毒过的块茎芽、顶芽、腋芽或茎段等进行剪切，切除下端药剂伤害的部分，接种在MS培养基或加激素的MS培养基上，在培养容器上注明品种名称和接种时间，放入培养室培养3周～4周。待芽长成含4片～5片叶子的小苗时，剪切成单节段，转接于同样的培养基上，培养成苗。同样方法扩繁1个～2个周期，待苗达一定数量后，从无菌苗上剥离茎尖。6.4.2培养条件：无菌苗在温度20℃~25℃、相对湿度70%、光照强度2000Lux～3000Lux的条件下培养，光照时数12h/d。6.5茎尖培养基的制备6.5.1茎尖培养基配方参见附录D。6.5.2将制备好的茎尖培养基分装于培养容器中，盖好盖子。6.5.3将制备好的培养基在高压蒸汽灭菌锅压力为1.1kg/cm2、温度为121℃条件下灭菌25min～30min，冷却后在洁净贮存室放置3d～5d备用。6.6茎尖剥离与接种6.6.1茎尖剥离与接种在超净工作台上操作。6.6.2茎尖剥离与接种按下列步骤进行：a)在解剖镜的载物台上放一张灭菌滤纸，将剪取的无菌苗茎尖放置于滤纸上；b)借助40X双目解剖镜，剥离茎尖直至露出半圆形光滑的生长点；c)用锋利的无菌解剖针切取0.2mm以下的带1个～2个叶原基的茎尖，迅速接种于茎尖培养基上，每瓶培养基内接种一个茎尖；d)已接种的培养基封好口后，在容器上注明编号、品种名称、接种时间。6.6.3在剥离过程中，应注意茎尖暴露的时间越短越好，切下的茎尖不应与已剥去部分、解剖镜台或持芽的镊子接触。每剥一个茎尖后，换一张无菌滤纸。6.7茎尖培养6.7.1培养条件：接种好的茎尖放在培养室内培养，温度20℃~25℃,光照2000Lux～3000Lux，每天光照12h。6.7.2茎尖成苗：茎尖培养两周后，成活的茎尖明显变大变绿，50d～60d左右茎尖长成带1片～2片小叶的无根小芽，转入MS培养基（配方参见附录B）中继续培养，30d左右长成带4片～5片叶子的完整试管苗。7病毒检测和品种真实性鉴定7.1病毒检测67.1.1在超净工作台上取出试管苗将每株按1节～2节切段，转入MS培养基（配方参见附录B）进行培养，每瓶接入一节段，新培养容器仍然使用与试管苗容器相同的编号和内容。7.1.2成苗后，每个编号的抽取一株用于病毒检测，检测方法执行NY/T401—2000的规定，通过检测筛选出不含PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM、PVA等病毒和PSTVd的脱毒苗核心苗。7.2品种真实性鉴定7.2.1试种观察：对应编号，将经检测不带病毒的试管苗取出一部分移栽到防虫网棚，结出的小薯种植到田间试种观察，检验其是否发生变异。7.2.2DNA分子标记：鉴定已脱毒的试管苗与原品种的关系，检测方法执行NY/T1963-2010的规定。若试管苗的DNA图谱与原品种的一致，则判定二者为同一品种。8核心苗保存与基础苗培养8.1操作步骤核心苗保存培养基配方见附录F，基础苗扩繁培养基用MS培养基（配方见附录B）或其它脱毒苗扩繁培养基（配方见附录E），步骤如下：a)在超净工作台上，用75%酒精擦拭消毒核心苗瓶和待用的新培养基的瓶表面，并置于超净工作b)用经灼烧消毒并冷却好的镊子取出核心苗置于无菌牛皮纸上；c)按茎节切段，每个切段带1个～2个叶片；d)从剪下的切段中取1段～2段，腋芽朝上插入核心苗保存培养基中上，封好口，注明编号、品种名称及接种时间；将其余节段接入基础苗扩繁培养基，封好口，注明编号、品种名称及接种时间。8.2培养条件8.2.1核心苗保存条件：核心苗保存要放入相对低温的种质资源保存室，使其缓慢生长保存。温度10℃~12℃、相对湿度70%、光照强度2000Lux～3000Lux、光照时数10h/d。8.2.2基础苗培养条件：温度22℃~25℃、相对湿度70%、光照强度2000Lux～3000Lux、光照时数12h/d。9组培苗扩繁9.1基础苗复检按照NY/T401—2000的附录A和附录B给出的方法进行检测。9.2培养基制备9.2.1培养基配制：选择用MS固体培养基（配方参见附录B）或其他扩繁培养基（配方参见附录E）。9.2.2培养基分装：将配制好的培养基装入培养容器中（常用350ml的罐头瓶），每瓶加入35ml~40ml的培养基，用封口膜或盖子封口。79.2.3培养基灭菌：将培养基置于高压蒸汽灭菌锅，在压力为1.1kg/cm2、温度为121℃条件下灭菌25min～30min，取出后在洁净贮存室放置3d～5d待用。9.3无菌接种无菌接种操作要求见第4章。9.4扩繁9.4.1检测合格的基础苗在超净工作台上切段扩繁，组培苗扩繁按以下程序操作：a)用75%酒精擦拭基础瓶苗和备用的培养基，表面消毒后放置于超净工作台上备用；b)打开基础母瓶，用无菌剪刀把苗从基部剪断，用无菌枪状镊子取出脱毒苗，置于事先准备好的无菌牛皮纸上；c)按茎节切断，每个切段带1个～2个叶片；d)用无菌镊子将剪好的茎段插到培养基上，腋芽朝上，每瓶插15个～20个茎段；e)封口后，用记号笔注明编号、品种名称、接种时间。9.4.2每个操作人员配备两套接种工具，交替灭菌使用。每接种完一瓶基础母瓶后，将镊子、剪刀等工具插入75%酒精浸蘸，并在酒精灯上灼烧数秒至酒精干透或插入接种工具消毒器消毒。转接下一个母瓶苗时，应使用另一套消毒好的接种工具，同时换一张无菌牛皮纸。9.5瓶苗培养9.5.1接种好的瓶苗放入培养室，白天22℃~25℃,夜间16℃~20℃,光照采用全自然光或人工光源日光灯：a)全自然光培养：玻璃或阳光板建成的全自然光培养室，光照强度控制在4000Lux～10000Lux，当光照强度超过10000Lux，光照强度过强，不利于组培苗的生长，要进行适当的遮阳；b)人工光源培养：光照强度2000Lux～3000Lux，光照时数16h/d。9.5.2待苗长出6片～7片叶片，株高7cm～8cm时，可再次切段繁殖或出瓶移栽。脱毒苗一般间隔25d左右继代繁殖一次。8（规范性）组培设施、设备及药品A.1组培设施和设备A.1.1防酸碱台面的试验台。A.1.2冰箱。A.1.3药瓶柜。A.1.4器械柜。A.1.5高压灭菌锅。A.1.6干燥箱。A.1.7空调和降温设施（湿帘、风机等）。A.1.8超净工作台。A.1.9培养架（人工光源培养室里的培养架须装有日光灯）。A.1.10浸泡洗涤水槽和冲洗水槽。A.1.11培养瓶控水架。A.1.12装培养瓶（或培养基）的塑料周转筐若干个。A.1.130.1g电子天平、0.0001g电子天平。A.1.14电动搅拌机。A.1.15磁力搅拌机。A.1.16酸度计。A.1.17蒸馏水器。A.1.18不锈钢锅或陶瓷桶。A.1.19电磁炉。A.1.20各种规格的容量瓶、棕色细口瓶、棕色广口瓶、移液管、烧杯、量筒、玻璃棒、吸管、洗耳球、试剂勺等。A.1.21大量的试管、三角瓶、培养瓶A.1.22瓶盖、封口膜、线绳。A.1.23紫外灯。A.1.24酒精灯。A.1.25镊子、剪刀、手术刀、解剖针、解剖刀。A.1.26温、湿度仪。A.2药品A.2.1氯化汞。A.2.2高锰酸钾。A.2.3次氯酸钠。A.2.475%乙醇、95%乙醇。泛酸钙。A.2.6硫脲。A.2.7新洁尔灭。A.2.8优氯净。A.2.9pH试纸。A.2.10琼脂、卡拉胶。A.2.11食用白糖、蔗糖。A.2.12附录B～附录E中的所有试剂。（规范）MS培养基配方和母液配制要求B.1MS培养基配方表B.1MS培养配方表硝酸铵(NHNO)磷酸二氢钾(KHPO)O)硼酸（HBO）2B.2MS培养基母液配制要求B.2.1大量元素母液的配制：大量元素用量相对较大，其中KNO3、NH4NO3在配制培养基时按实际配制的体积来称取，随称随用，其余3种以每种试剂单独配制成母液。B.2.2微量元素母液的配制：7种微量元素逐一称取、溶解后定容成一种母液。B.2.3铁盐母液的配制：两种试剂分别称量并分别加热