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文档简介
谷氨酸棒杆菌中分枝硫醇抗环境胁迫的作用机制研究谷氨酸棒杆菌不仅是一种非常重要的工业微生物(主要用于氨基酸和维生素的生产),而且是微生物研究中的模式生物。在工业微生物发酵过程中,不可避免会受到各种各样的环境胁迫,从而对其生产性能产生严重影响。这些不利的环境胁迫均有一个共同的效应—氧化应激,即通过过量活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS)的产生而引起生物大分子的损伤,从而打破胞内氧化还原平衡,造成细胞功能紊乱,导致细胞损伤乃至凋亡。因此,如何提高谷氨酸棒杆菌在逆境下的鲁棒性也成为目前提高其生产性能的一个关键问题。生物体已进化出对抗氧化应激损伤的一套强有力的抗氧防御机制,包括抗氧化物酶系统和小分子量抗氧化剂(LMMA),其中小分子量抗氧化剂主要是一些小分子的硫醇,包括半胱氨酸(Cys)、辅酶A(CoA)、维生素C、E,谷胱甘肽(glutathione,GSH)和分枝硫醇(Mycothiol,MSH)等。其中关于GSH的研究最为透彻,其代谢途径、生理功能及解毒和抗氧化应激作用的内在分子机制已得到深入解析。然而,包括谷氨酸棒杆菌在内的放线菌目等大量具有重要经济、医学研究价值的微生物自身并不具备合成GSH的代谢途径,而是以MSH为胞内主要硫醇。研究表明MSH也具有与GSH相似的生理功能,能维持胞内的氧化还原平衡,并涉及活性氧和活性氮、抗生素、氧化剂、烷化剂、重金属、酸、有机溶剂、芳香化合物及异源物质的清除或解毒。我们前期的研究表明MSH过量合成可明显提高谷氨酸棒杆菌在多种环境胁迫下的鲁棒性和存活能力。因而,MSH的抗环境胁迫性能就成为塑造放线菌目一些重要微生物鲁棒性的重要手段。但目前相关研究主要围绕MSH的代谢途径、生理功能和MSH作为新型药靶展开,关于MSH参与环境胁迫耐受性的内在分子作用机制的挖掘则未得到应有的重视。因而,本研究以谷氨酸棒杆菌这一重要的模式微生物作为研究对象,以期揭示分枝硫醇赋予谷氨酸棒杆菌抵抗环境胁迫的外在生理表型下的内在作用机制,主要研究结果如下:1.蛋白S-硫醇化修饰是机体应对氧化应激的一种重要的硫醇保护和氧化还原开关机制,是机体在氧化应激应答下的一种普遍存在的翻译后可逆修饰。但是,目前关于各种环境胁迫下分枝硫醇化蛋白修饰的报道非常有限,开发一种可系统检测S-分枝硫醇化蛋白的方法极为必要。因此,以ΔmshC(该突变株完全丧失了合成分枝硫醇的能力)作为对照,将生物素-链霉亲和素技术与专一的还原MSH与蛋白之间混合二硫键的Mrx1:C15S/MSH/Mtr及特异的仅还原分子内或分子间二硫键的Trx/TrxR还原系统相偶联,从野生型谷氨酸棒杆菌中鉴定了12个在环境应激下经过S-分枝硫醇化修饰的蛋白:包括参与代谢的酶,如蛋氨酸合成酶(MetE)、1-磷酸-肌醇合成酶(Ino1)、糖激酶(XylB)和腺苷酸激酶(Adk);抗氧化物酶,如蛋氨酸亚砜还原酶(MsrA)、分枝硫醇过氧化物酶(Mpx)、硫醇过氧化物酶(Prx);核酸合成途径的酶,如肌苷-5-单磷酸脱氢酶(GauB1和GauB2);与翻译有关的酶,如苯丙酰氨-tRNA合成酶亚基(PheT)、30S核糖体蛋白S3(RpsC)和50S核糖体蛋白L13(RplM)。其中,Ino1、MsrA、Mpx、MetE和Prx在H2O2、CdCl2、CDNB及氧氟沙星胁迫下的野生型菌中均被检测出来。说明我们建立了一种高选择性、高灵敏度、低干扰、能区分其它硫醇化修饰与分枝硫醇化修饰的S-分枝硫醇化蛋白修饰检测方法。进一步通过WesternBlotting和质谱技术对环境胁迫下的Δino1(pXMJ19-His6-ino1)、ΔmsrA(pXMJ19-His6-msrA)、Δmpx(pXMJ19-His6-mpx)、Δprx(pXMJ19-His6-prx)和ΔmetE(pXMJ19-His6-metE)菌株中相应的6×His标记蛋白的检测,证实我们建立的方法是正确可靠的。2.揭示了MSH在抗环境胁迫中的内在作用机制:(1)作为细胞内主要的氧化还原缓冲剂可直接与环境应激产生的ROS反应而解毒;(2)参与代谢酶翻译后的修饰(MetE和Ino1)而形成解毒过程产物饥饿的现象,进而关闭相关代谢途径,防止细胞进一步被破坏;(3)MSH充当抗氧化物酶Mpx和MsrA的辅因子,共同完成过氧化物或者ROS的清除;(4)MSH直接与烷化剂、氧化剂(甲萘醌)、抗生素(利福霉素)、重金属等环境应激物相结合,作为分枝硫醇硫转移酰胺酶(Mca)的底物而被解毒;(5)环境胁迫下分枝硫醇化的Prx起结构和功能开关的作用。3.揭示了σH在不同环境胁迫下调控谷氨酸棒杆菌中的抗氧化物酶和MSH合成相关酶的机制。我们发现,各种环境胁迫(包括氧化剂、烷化剂、抗生素及重金属)均会诱导谷氨酸棒杆菌中mca、mtr、msrA和m
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