疏水作用色谱和共价色谱-高等生物分离技术

疏水作用色谱和共价色谱

袁辉2014.12.30

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疏水作用色谱（Hydrophobicinteractionchromatography，HIC）

3疏水作用色谱（HIC）什么是疏水色谱？介质是什么，怎么选?影响疏水作用的因素

HIC的应用总结4什么是疏水色谱？OverviewConceptInteractionprincipleMainstagesinHIC5Whatisitandwhereisfrom？Hydrophobicinteractionchromatographyisaliquidchromatographytechniquethatseparatesbiomoleculesaccordingtotheirhydrophobicity6overview疏水层析分离的概念早在1948年就由Tiselius提出，但真正发展是1970年开发出一系列适合疏水层析的固定相以后。

疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品。目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面，成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的有效手段。7concept疏水色谱，又称疏水作用层析（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。疏水作用层析的基本原理如图所示。（即配基）8concept---不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水性弱的物质，在较高的离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来。疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。疏水作用层析的基本原理如图所示。9

WhyshouldIuseit?Complementarytoionexchange(离子交换色谱，IEX)andgelfiltration(凝胶色谱，GF)Mild,non-denaturingHighselectivityHighrecovery(高回收率)Concentratingtechnique（高效富集技术）10Interactionprinciple作用机制SoluteSurfaceexposedHydrophobicGroups表面疏水配基Ligands配体WatermoleculesWatermoleculesinbulk作用后的水DG=DH-T

DSGelmatrix基质11MainstagesinHIC主要阶段Equilibratethegelandthesampletobindingconditions平衡凝胶和样品结合条件Applythesample加样Washoutcontaminants除污杂物Elute洗脱12Equilibration平衡凝胶和样品结合条件1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionEquilibratethecolumnandadjustthesampletobindingconditions平衡色谱柱调整样品的结合条件Hydrophobicligand疏水配体Gelmatrix基质Watermolecules13Sampleapplication加样1.Equilibration2.Sampleapplication3.

Washing4.ElutionGelmatrixProteinsHydrophobicgroups疏水基团14Washingoutunboundmaterial洗脱未结合的物质1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.Salt盐浓Abs吸光度Non-boundproteins未结合的自由蛋白15Elution洗脱（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）

（2）通过往流动相中添加有机溶剂，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱（溶剂中稳定性良好的物质）（3）往流动相中添加去污剂等，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）

16Elution洗脱目标物1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionTargetelutes目标蛋白的洗脱Conc.saltAbs17Elution洗脱Conc.saltAbs1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionMorestronglyboundproteins更强结合的目标蛋白的洗脱18疏水作用色谱（HIC）什么是疏水色谱？介质是什么?影响疏水作用的因素

HIC的应用总结19介质是什么?基质配基常见的介质介质的再生和贮存20介质（基质+配基）基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。

近年来研制超大(superporous)琼脂糖，在扩散孔的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好的分辨率。壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来在疏水层析中也得到了应用21基质Cross-linkedagarose交联琼脂糖Syntheticcopolymermaterials高分子聚合物SOURCE15AGAROSE22HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基。

R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反应物的比例可控制介质的配基密度

配基23偶联基质的常见配基类型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基

配基24对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，为洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。常见配基的选择25常用商品化疏水层析介质⒈OctylSepharose（辛基琼脂糖）4FastFlow

工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为50μmol/ml正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。⒉ButylSepharose（丁基琼脂糖）4FastFlow

工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为50μmol/ml正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。⒊PhenylSepharose（苯基琼脂糖）6FastFlow

疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，配基结合量为40μmol/ml苯基

，工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h。26层析介质的再生、贮存

再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强的物质如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需合适的清洗剂进行清洗，NaOH溶液是其中常用的一种清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微生物钝化灭活起到消毒的效果。此外，促溶盐类的水溶液也是良好的清洗剂。贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶液体系中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微生物的生长

27疏水作用色谱（HIC）什么是疏水色谱？介质是什么，怎么选?影响疏水作用的因素

HIC的应用总结28影响疏水作用的因素配基的种类和密度盐的种类和浓度PH值温度流动相速率的影响其他29配基的种类和密度配基的类型决定了HIC介质对生物大分子物质吸附的选择性，一般说来：直链烷烃的配基---纯的疏水性芳香族的配基---疏水性和π-π电子共轭效应30不同的介质对同一样品有不同的分离效果：31盐的种类和浓度盐的种类选择对HIC非常重要，其能产生良好的盐析效应，还要有高的溶解度，黏度，紫外吸收和稳定性。---硫酸铵盐的浓度对蛋白质吸附影响很大。平衡缓冲液和样品溶液的高浓度能促进蛋白质和配体的结合，甚至蛋白质吸附量的增加和盐浓度大体上成线性关系32盐的种类的影响

1.7M(NH4)2SO41MNa2SO43MNaCl0.510200A280mlml0.510200A2800.510200A280ml分离丁基琼脂糖33流动相中盐浓度对蛋白质结合的影响

ToohighOptimalToolow204000.5A280min2.01.0mol/lTargetprotein0.5minA280200mol/l2.01.0A280200mol/l2.01.00.5min2M(NH4)2SO41M(NH4)2SO40.8M(NH4)2SO434PH值的影响---一般在接近中性的条件下进行pH的改变必然改变蛋白质的电荷性质及电荷量，从而影响蛋白质与色谱填料间的静电相互作用，也影响蛋白质在色谱柱上的保留行为。由于每一种蛋白质在某一特定pH条件下，其空间构象、所带电荷情况不一致，因此，pH对蛋白质在色谱柱上保留行为的影响具有一定的复杂性。ProteinbindingtoHIC-mediaisgenerallynotchangedmuchbetweenpH5and8.5。35温度一般情况下在HIC中，升高温度有利于蛋白质的结合吸附，降低温度有利于蛋白质的洗脱。其主要是因为HIC是一个熵驱动的过程，增加温度有利于蛋白质与配基间的相互作用。（但要注意温度的控制勿是蛋白质失活）36温度的影响2.03.04.05.023°CSample&SystemA280Time(min)2.03.04.05.04°CSample&

SystemA280Time(min)SOURCE™15ISO37流动相速率的影响1800cm/h900cm/h300cm/h1234AU280min2AU280min110AU280min5123438其他在疏水色谱的洗脱液中有时要加入一些添加剂、去污剂等。它们可以通过竞争结合到疏水配基上，可改善蛋白质的溶解性或修饰蛋白的构象，而使结合在柱上的蛋白质更易被洗脱下来。39疏水作用色谱（HIC）什么是疏水色谱？介质是什么，怎么选?影响疏水作用的因素

HIC的应用总结40HIC的应用Purificationofrecombinanta-mannosidasefromPichiapastoris从毕赤酵母中提纯β-甘露糖苷酶Purificationofrecombinantphosphatase重组磷酸酶的纯化PurificationofrhGM-CSFfrominclusionbodiesproducedinE.coli从大肠杆菌产生的包涵体提纯rhGM-CSF41应用的特点1互补工具：HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相当。2与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。42Purificationofrecombinanta-mannosidasefromPichiapastoris从毕赤酵母中提纯β-甘露糖苷酶AIEX离子交换TechniqueUltrafiltrationUF超滤Superdex200p.g.GF凝胶色谱Purification

factorQSepharoseFF

10timespurification

82%yield10次的纯化可得到82%产率PhenylSepharoseHPHICY.-F.Liaoetal.(1996)J.Biol.Chem.271,283486362271943Sample: 170mleluatecontainingrPhosphatasefromaDEAESepharoserun, adjustedto1.6M(NH4)2SO4,pH7.0Column: HiLoad16/10PhenylSepharoseHighPerformanceBufferA: 25mMTris-HCL,1.4M(NH4)2SO4,1mMEDTA,2mMDTT,pH7.4BufferB: 25mMTris-HCL,10%glycerol,1mMEDTA,2mMDTT,pH7.4System: ÄKTAprime,5.0ml/min(150cm/h),0-100%Bin20CVPurificationofrecombinantphosphatase

重组磷酸酶的纯化44PurificationofrhGM-CSFfrominclusionbodiesproducedinE.coli

从大肠杆菌产生的包涵体提纯rhGM-CSFPhenylSepharoseFFQSepharoseFFSuperdex75PrepGradeHICIEXGFRenaturedrhGM-CSFRemovesbufferconstituents(Guanidine-HCl,Berol185,glutathioneetc)Recovery:92%ofactivityBelew,M.etal.(1994)J.Chromatogr.A,679:67-8345总结Complementarytoionexchange(离子交换色谱，IEX)andgelfiltration(凝胶色谱，GF)Mild,non-denaturingHighselectivityHighrecovery(高回收率)Concentratingtechnique（高效富集技术）46

共价作用色谱

47共价作用色谱什么是共价色谱？共价色谱的作用过程阶段共价色谱的应用

48什么是共价色谱？ConceptTomographicagent层析剂49Concept共价作用色谱：利用溶质分子与层析剂凝胶之间的共价吸附作用讲目标产物与其他溶质分子分离开来的一种分离方法。如将含有二硫键的配基固定在色谱介质上，利用蛋白质表面的硫醇基团与二硫键通过可逆的化学结合，以吸附蛋白质。

50Tomographicagent层析剂其前提是要先制备层析剂---有共价反应活性的二硫键层析剂可由葡聚糖凝胶或者琼脂糖凝胶制得。51共价色谱的作用过程阶段吸附过程洗脱过程再生过程52吸附过程蛋白质中违背氧化的半胱氨酸残基带-SH，与层析剂上的二硫键发生共价交换反应。蛋白质被结合到层析剂上，如果吸附后，柱上有剩余的未反应的巯基吡啶基团，此时可用二硫苏糖醇和醋酸钠缓冲液洗涤除去。53洗脱过程洗脱可以用L-半胱氨酸、巯基乙醇、谷胱甘肽及二硫苏糖醇等巯基化合物在中性条件下进行。

洗脱时若使用还原能力逐次增强的巯基化合物或者逐次增加巯基化合物的的浓度都可以增加蛋白质的洗脱分辨率，提高其选择性。54再生过程洗脱后的层析剂，需要用2,2’-吡啶基二硫