第十八章 电泳

第十八章电泳第1页，课件共41页，创作于2023年2月2、高效毛细管电泳技术基本原理

最基本的高效毛细管电泳仪器如图1所示：图1毛细管电泳基本仪器结构示意图HV.高压电源(0~30kV)；C.毛细管；E.电极槽；Pt.铂电极；D.在柱检测器；S.样品；DA.数据采集处理系统第2页，课件共41页，创作于2023年2月样品在毛细管中的分离过程如图2所示：分离过程：电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。

正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；

中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；

阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。

图2毛细管电泳分离示意图第3页，课件共41页，创作于2023年2月3、毛细管电泳的特点

由于毛细管具有良好的散热效能，允许在窄内径毛细管两端加上高达30kV的高电压，分离毛细管的纵向电场强度可达400V/cm以上，可以在很短的时间内达到很高的分离效率，具有以下特点：

（1）分离速度快（高压、高电场强度）在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子（2）分离效率高（N>105~106）（3）运行成本低（4）样品与试剂消耗量少（1~50nL）（5）可供选择的分离模式多，应用范围广（6）分离一般在水溶液介质中进行（7）方法简单，仪器自动化程度高（8）环境污染小第4页，课件共41页，创作于2023年2月表1

高效毛细管电泳与高效液相色谱性能比较

第5页，课件共41页，创作于2023年2月4、毛细管电泳简单历史

（1）1967年Hjerten首先报道了开管毛细管电泳，后来Virtanen和Mikkers先后分别在约200

m内径的玻璃或Teflon毛细管中进行电泳，这些是毛细管电泳的最初期工作。（2）1981年，Jorgenson和Lukacs使用75

m内径100cm的玻璃毛细管在30kV的高电压下进行电泳，获得了数十万理论塔板数的高分离效率，使毛细管电泳技术有了突破性进展。第6页，课件共41页，创作于2023年2月

（3）1984年，Terabe发展了毛细管电泳的新分支-毛细管胶束电动色谱(MEKC)（4）1987年,Hjerten提出了毛细管等电聚焦(CIEF)。同年，Cohen和Karger发表了毛细管凝胶(CGE)的研究工作。到此为止，毛细管电泳所有传统分离模式全部诞生，标志着毛细管电泳技术的发展成熟。第7页，课件共41页，创作于2023年2月

图3常用几种型号的高效毛细管电泳仪第8页，课件共41页，创作于2023年2月二、高效毛细管电泳仪器流程和主要部件

电压：0～30kV；分离柱不涂敷任何固定液；紫外或激光诱导荧光检测器；（可检测到：10-19～10-21mol/L）图4高效毛细管电泳流程图

图5高效毛细管电泳基本装置第9页，课件共41页，创作于2023年2月1.高压电源（1）0～30kV稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；2.毛细管柱

（1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；（2）规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度<=1m3.缓冲液池

化学惰性，机械稳定性好4.检测器

要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；第10页，课件共41页，创作于2023年2月

类型检测限/mol特点紫外-可见10-13～10-15加二极管阵列，光谱信息荧光10-15～10-17灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光10-18～10-20灵敏度极高，样品需衍生电导10-18～10-19离子灵敏，需专用的装置表2各种类型检测器性能列表5、高效毛细管电泳进样方式进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小(1)流体力学进样方式a、进样端加压b、出口端抽真空c、虹吸进样第11页，课件共41页，创作于2023年2月（2）电动进样方式毛细管一端插入样品瓶，加电压；特点：进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度小的进样量大；离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；特别适合黏度大的试样（3）扩散进样试样通过扩散作用进入分离柱端口处第12页，课件共41页，创作于2023年2月三、高效毛细管电泳理论（theoryofHPCE）（一）高效毛细管电泳(HPCE)基本原理

电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。淌度μ：单位电场强度下的平均电泳速度

第13页，课件共41页，创作于2023年2月（二）电渗现象与电渗流(electroosmosisandelectroosmoticflow)1、电渗流现象

当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。图6毛细管电泳中的电渗现象

当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。

电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。第14页，课件共41页，创作于2023年2月2、HPCE中的电渗现象与电渗流

石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。

在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。

图7毛细管电泳中电渗现象和电渗流第15页，课件共41页，创作于2023年2月3、HPCE中电渗流的大小与方向（1）电渗流大小计算公式电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。即ν电渗流=μE电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即μ=ε0εξε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势（扩散层电势）

。ν电渗流=ε0εξE实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算

ν电渗流=Lef/teoLef—毛细管有效长度；teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。第16页，课件共41页，创作于2023年2月

（2）HPCE中电渗流的方向

电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极改变电渗流方向的方法：

（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。第17页，课件共41页，创作于2023年2月4、HPCE中电渗流的流形

电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。图8毛细管电泳电渗流流形和液相色谱流形的比较第18页，课件共41页，创作于2023年2月5、HPCE中电渗流的作用

电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；

各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：

ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。第19页，课件共41页，创作于2023年2月（三）HPCE中影响电渗流的因素1、电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2、毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；

图9不同材料毛细管pH对电渗流的影响第20页，课件共41页，创作于2023年2月3、电解质溶液性质的影响（1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。第21页，课件共41页，创作于2023年2月图10离子强度对电渗流的影响第22页，课件共41页，创作于2023年2月4、温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；

HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1oC，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；第23页，课件共41页，创作于2023年2月5、添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。第24页，课件共41页，创作于2023年2月第25页，课件共41页，创作于2023年2月（四）淌度（mobility）淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。1、绝对淌度(absolutemobility)μab无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2、有效淌度(effectivemobility)μef实际溶液中的淌度(实验中测定的)。μef=∑aiμiai—溶质i的解离度；μi—溶质i在解离状态下的绝对淌度3、表观淌度μap离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：νap=μapE第26页，课件共41页，创作于2023年2月（五）HPCE中的参数与关系式1、迁移时间（保留时间）HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。V—外加电压；L—毛细管总长度2、分离效率（塔板数）

在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt

扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。第27页，课件共41页，创作于2023年2月3、分离度

影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算。（六）影响分离效率的因素—区带展宽

1、纵向扩散的影响在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ2=2Dt由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。第28页，课件共41页，创作于2023年2月2、进样的影响

当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24Dt)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。3、焦耳热与温度梯度的影响

电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：

m—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cb—电解质浓度；散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；第29页，课件共41页，创作于2023年2月4、溶质与管壁间的相互作用

存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小吸附的方法和途径：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。第30页，课件共41页，创作于2023年2月5、其他影响因素（1）电分散作用对谱带展宽的影响

当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。（2）“层流”现象对谱带展宽的影响一般情况下，HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；产生的原因：毛细管两端液面高度不同。实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。第31页，课件共41页，创作于2023年2月四、高效毛细管电泳分离模式1、毛细管电泳分离模式：区带毛细管电泳(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)毛细管胶束电动色谱(micellarelectrokineticcapillarychromatography,MEKC)毛细管凝胶电泳(capillarygelelectrophoresis,CGE)毛细管等电聚焦(capillaryisoelectricfocusing,CIEF)毛细管等速电泳(capillaryisotachophoresis,CITP)毛细管阵列电泳(capillaryarrayelectrophoresis,CAE)根据试样性质不同，采用不同的分离类型；每种机理的选择性不同第32页，课件共41页，创作于2023年2月五、高效毛细管电泳应用（一）应用1、离子分析（analysisofion）

阳离子分析迁移方向和电渗流方向一致；4.5min内分离了24种金属离子；阳极进样，阴极检测；具有很高的灵敏度；

图13阳离子分离毛细管电泳图第33页，课件共41页，创作于2023年2月阴离子分析

阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测；离子价态及存在形态分析

图14阴离子毛细管分离图第34页，课件共41页，创作于2023年2月2、药物分析

检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离17种药物图1517种药物毛细管电泳分离图第35页，课件共41页，创作于2023年2月采用MEKC（毛细管胶束电动色谱）模式，鉴定违禁药物；效果优于HPLC法

图16违禁药物毛细管胶束电动色谱分离图第36页，课件共41页，创作于2023年2月