化妆品光反应性活性氧（ROS）测定体外皮肤变态反应U937细胞激活

———附件5光反应性活性氧（ROS）测定试验方法ReactiveOxygenSpecies(ROS)AssayforPhotoreactivity1范围本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧（ROS）测定试验的基本要求和方法。本方法适用于预测化妆品用化学原料的潜在光毒性。2试验目的预测化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。3定义下列术语和定义适用于本方法。3.1光反应性Photoreactivity化学物质由于吸收光子而与另一个分子发生反应的性质。3.2光毒性Phototoxicity皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照射下发生的类似反应。本方法所述光毒性包括光刺激性、光过敏性和光遗传毒性。3.3辐照度Irradiance照射到某一表面的紫外线或可见光的强度，单位为瓦每平方米（W/m2）或毫瓦每平方厘米（mW/cm2）。3.4光照剂量Doseoflight照射到某一表面的紫外线或可见光的量[=强度×时间（秒）]，单位为焦耳每平方米（J/m2）或焦耳每平方厘米（J/cm2）。3.5活性氧种类ReactiveOxygenSpecies，ROS活性氧种类，包括单线态氧和超氧阴离子。3.6单线态氧SingletOxygen，SO由光辐照化学物质通过Ⅱ型光化学反应产生的一种自由基。3.7超氧阴离子SuperoxideAnion，SA由光辐照化学物质通过I型光化学反应产生的一种自由基。4试验原理一些具有光反应性的化学物质暴露于紫外线时，吸收某一波长光子，诱导发色团激发，激发能量转移到氧分子上，发生光化学反应，产生活性氧（包括单线态氧SO和超氧阴离子SA），活性氧是光毒性反应中的重要中间物质。单线态氧和咪唑反应生成的过氧化物中间体对N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。超氧阴离子与氯化硝基四氮唑蓝（NBT）反应生成NBT+，其在560nm波长下具有光吸收。本试验方法通过分光光度法测定化学物质经紫外线照射后对RNO在440nm下吸光度的减少及对NBT+在560nm下吸光度的增加来判断该化学物质是否具有光反应性。5试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂应在配制后1个月内使用，并且在使用前应超声处理，以免物质析出、沉淀对试验造成影响。主要试剂配制方法如下：5.1磷酸二氢钠。5.2磷酸氢二钠。5.3N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO）。5.4咪唑。5.5氯化硝基四氮唑蓝（NBT）。5.6pH7.4的20mmol/L磷酸钠缓冲液（NaPB）称取593mgNaH2PO4·2H2O（CAS：13472-35-0）和5.8gNa2HPO4·12H2O（CAS:10039-32-4），加入约900mL水，混匀，用1mol/L的HCl将pH值调节为7.4，定容至1000mL后混匀。于2℃~8℃冰箱或室温保存。5.70.2mmol/LN,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO，CAS：138-89-6）称取3mgRNO，溶于100mL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.80.2mmol/L咪唑（CAS：288-32-4）称取13.6mg咪唑，溶于10mL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀，得到20mmol/L咪唑溶液。用20mmol/L的磷酸钠缓冲液将20mmol/L咪唑溶液稀释100倍，充分混匀。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.90.4mmol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT，CAS：298-83-9）称取32.7mgNBT，溶于100mL20mmol/L的磷酸钠缓冲液中，充分混匀。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.10溶剂的选择优先使用分析级二甲基亚砜（DMSO）。对于不溶于DMSO的受试物，可使用20mmol/L的磷酸钠缓冲液作为溶剂。如果受试物在DMSO和磷酸钠缓冲液中不溶或不稳定，也可使用其他溶剂，但应保证受试物在所选溶剂中稳定，且参考化学物质的SO值和SA值应在附录A规定的范围内。5.11待测化学物质溶液的配制待测化学物质的分子量应是已知的。测试终浓度为200μmol/L，如果在200μmol/L浓度下的反应混合物有沉淀、着色或其他干扰等现象，则可以使用20μmol/L为终浓度进行测试。当待测化学物质在20μmol/L的终浓度下得到阳性结果，表示该物质具有光反应性；但在浓度低于20μmol/L下得到阴性结果，不能表示该物质无光反应性。待测化学物质溶液应现用现配，所有操作均应避免在强紫外线和强可见光照射（例如头顶灯下或在自然光暴露的窗户附近工作），以避免在试验前待测化学物质发生光激活或光降解。待测化学物质在试管中称重，加入5.10项溶剂，涡旋混匀，超声5-10min，配制成10mmol/L（终浓度200μmol/L）。当终浓度200μmol/L的反应混合物在光照前观察到沉淀、着色或其他干扰等现象时，需将10mmol/L的溶液用DMSO稀释成1mmol/L溶液（终浓度20μmol/L）。对于不溶于DMSO的化学物质，使用其他溶剂（如磷酸钠缓冲溶液）时，须使得反应混合物中含有20μLDMSO（2%，v/v）。5.12阴性对照及阳性对照以奎宁盐酸盐二水合物（CAS：6119-47-7）作为阳性对照，以二苯甲酮-4（CAS：4065-45-6）作为阴性对照。用DMSO按与受试物相同的方法将阳性对照和阴性对照配制成10mmol/L的储备溶液，分装后于-20℃冰箱冻存，于使用当天解冻，避免反复冻融，1个月内使用完毕。6仪器和设备6.1太阳光模拟器6.1.1选择合适的光源用于提供紫外线和可见光的照射，通过滤光片减少波长小于290nm的UVC，使光源尽量接近室外日光。推荐的测试条件如下：配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线波长<290nm）（见附录B）—辐照度：1.8mW/cm2至2.2mW/cm2，照射1小时（例如，AtlasSuntestCPS+的指标设置值为250W/m2），—UVA光照剂量：6.5J/cm2至7.9J/cm2（见附录B）。配备滤光片的太阳模拟器（减少紫外线波长<300nm）（见附录B）—辐照度：3.0mW/cm2至5.0mW/cm2，照射1小时（例如，SericSXL-2500V2），—UVA光照剂量：11J/cm2至18J/cm2（见附录B）。6.1.2测试条件根据实际选择合适具体条件。6.1.3ROS的产生受温度影响，太阳光模拟器应配备温度控制装置，光照期间温度在20℃~29℃。6.2反应容器推荐使用石英反应容器（规格见附录C），避免液体蒸发以及由于塑料盖造成的UV损失。也可使用其他UV透射率大于95%的盖子或密封件替代。实验室使用其他容器时，应使用附录A中的参考化学物质（序号1-17号）确定合适的仪器辐照度及光剂量。6.3酶标仪。6.4UVA紫外照度计。6.5显微镜。7分析步骤7.1将下列成分在避光条件下混合：7.1.1溶剂为DMSO的受试物：单线态氧SO超氧阴离子SA20mmol/LNaPB480μL0.2mmol/L咪唑250μL0.2mmol/LRNO250μL10或1mmol/L受试物20μL20mmol/LNaPB855μL0.4mmol/LNBT125μL10或1mmol/L受试物20μL7.1.2溶剂为NaPB的受试物：单线态氧SO超氧阴离子SA20mmol/LNaPB460μL0.2mmol/L咪唑250μL0.2mmol/LRNO250μLDMSO20μL10或1mmol/L受试物20μL20mmol/LNaPB835μL0.4mmol/LNBT125μLDMSO20μL10或1mmol/L受试物20μL以20μL溶剂替代受试物，作为空白对照。涡旋或超声5~10min后，将200μL反应混合物加入到96孔板中，每组设置3个平行。96孔板加样详见附录D。7.2在100倍显微镜下检查反应混合物中各组分溶解情况。如有沉淀、析出等现象，需降低受试物浓度重新检测或停止检测。将96孔板震荡5s后，使用分光光度计或酶标仪测定光照前SO检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。7.3将96孔板置于石英反应器中，或盖上其他具有高UV透射率的盖子或密封件，置于太阳光模拟器中照射1h。记录光照前后的温度。7.4完成光照后，将96孔板震荡1min，使用分光光度计或酶标仪测定光照后SO检测孔在440nm下的吸光度及SA检测孔在560nm下的吸光度。步骤流程图见附录E8分析结果表述8.1SO值和SA值的计算计算受试物及对照品的SO值和SA值，根据三个平行孔的数据计算平均值和标准偏差。1．根据光照前后SO测试孔在440nm下的吸光度计算受试物的SO值SO式中：A440(-)：光照前440nm下的吸光度A440(+)：光照后440nm下的吸光度a：光照前空白对照440nm下的吸光度（平均值）b：光照后空白对照440nm下的吸光度（平均值）2．根据光照前后SA测试孔在560nm下的吸光度计算受试物的SA值SA式中：A560(-)：光照前560nm下的吸光度A560(+)：光照后560nm下的吸光度a：光照前空白对照560nm下的吸光度（平均值）b：光照后空白对照560nm下的吸光度（平均值）8.2试验接受标准试验应满足以下标准：1．光照前，反应混合物中没有受试物沉淀。2．光照前后，受试物对反应混合物没有颜色干扰。3．试验过程中温度控制在20℃~29℃范围内。4．所有测试孔A440及A560应在0.02~1.5范围内。5．应根据历史数据平均值±2标准偏差建立实验室内阴性对照与阳性对照的质控范围。以下为根据验证数据得出的95%置信区间：200μmol/L奎宁盐酸盐二水合物200μmol/L二苯甲酮-4SO：319至583SA：193至385SO：-9至11SA：-20至28.3受试物的光反应性评判标准根据以下标准评判受试物的光反应性：分类样品浓度SOSA具有光反应性200μmol/L≥25和≥70<25和/或有干扰和≥70≥25和<70和/或有干扰具有弱光反应性200μmol/L<25和≥20，<70具有光反应性20μmol/L≥25和≥20无光反应性200μmol/L<25和<20不确定不属于上述任何一种情况如受试物在200μmol/L和20μmol/L浓度下均有沉淀、着色或其他干扰，则认为该受试物不适用于本方法，受试物的光反应性不确定。9其他限制说明在活性氧（ROS）检测过程中，会发生如下两个反应：单线态氧和咪唑反应生成的过氧化物中间体对N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNO）具有漂白作用；超氧阴离子与氯化硝基四氮唑蓝（NBT）反应生成NBT+。该方法不适用于对上述两个反应产生干扰的化学品测试，例如，抗坏血酸和其他还原性化学品，它们会将四唑盐直接还原为甲瓒，抗坏血酸还加速咪唑衍生物的氧化，在ROS测定中提供假阳性预测。

附录A参考化学物质检测结果可接受范围表117种参考化学物质SO值和SA值测定数据的可接受范围。编号化学物名称CAS编号SOSA溶剂浓度1对氨基苯甲酸150-13-0-8~12-11~7DMSO200μmol/L2对氨基苯甲酸乙酯94-09-7-7~9-7~17DMSO200μmol/L3盐酸多西环素10592-13-9115~429230~468DMSO200μmol/L4红霉素114-07-8-15~11-9~21DMSO200μmol/L5非诺贝特49562-28-977~203-31~11DMSO20μmol/L6L-组氨酸71-00-1-8~128~120NaPB200μmol/L7诺氟沙星70458-96-7131~27157~161DMSO200μmol/L88-甲氧基补骨脂素298-81-731~1370~126DMSO200μmol/L9水杨酸异辛酯118-60-5-5~11-8~20DMSO20μmol/L10吖啶260-94-6182~328121~243DMSO200μmol/L11盐酸氯丙嗪69-09-0-56~7066~106DMSO200μmol/L12双氯芬酸钠15307-79-634~41647~437DMSO200μmol/L13呋噻米54-31-931~225-7~109DMSO200μmol/L14酮基布洛芬22071-15-4120~34677~151DMSO200μmol/L15萘啶酮酸389-08-254~24688~470DMSO200μmol/L16奥美拉唑73590-58-6-221~10330~216DMSO200μmol/L17盐酸异丙嗪58-33-320~168-3~77DMSO200μmol/L

附录B太阳光模拟器光谱分布图1推荐的两种太阳光模拟器的光谱能量分布

附录C石英反应容器聚四氟乙烯板聚四氟乙烯板石英片石英片固定夹多孔板固定夹多孔板图2石英反应容器推荐规格图示石英盖板推荐厚度为3mm附录D96孔板加样示意图96孔板加样示例如下：123456789101112A单线态氧SO检测孔BBPNT1T2T3T4T5T6T7CBPNT1T2T3T4T5T6T7DBPNT1T2T3T4T5T6T7EBPNT1T2T3T4T5T6T7FBPNT1T2T3T4T5T6T7GBPNT1T2T3T4T5T6T7超氧阴离子SA检测孔注：1.B为空白对照；2.P为阳性对照（奎宁盐酸盐二水合物），N为阴性对照（二苯甲酮-4）；3.T1-T7为第1至第7种受试物。

附录E试验流程图将各反应成分在避光条件下混合↓混合（涡旋或者超声5-10分钟）↓200μL混合物加入到96孔板中（每组3个平行）↓100倍显微镜下检查溶解情况↓震荡5s后，检测440nm和560nm吸光度↓光照1小时↓震荡1min后，检测440nm和560nm吸光度附件6体外皮肤变态反应U937细胞激活试验方法U937CellLineActivationTest1范围本方法规定了体外皮肤变态反应U937细胞激活试验的基本原则、要求和方法。本方法适用于化妆品用化学原料潜在致敏性的评价。2试验目的本试验用于检测体外培养的人组织细胞淋巴瘤细胞表面标记物CD86的表达变化，以评价受试物引起皮肤变态反应的可能性。3定义3.170%细胞存活率浓度值70%cellviability（CV70）受试物染毒后，细胞存活率为70%时对应的受试物浓度值。3.2刺激指数stimulationindex（S.I.）与溶剂对照相比，扣除同型对照后流式细胞仪测定的受试物阳性细胞相对强度值。3.3CD86有效作用浓度值EffectiveConcentration150（EC150）CD86的相对荧光强度值达到150时对应的受试物浓度值。4试验的基本原则当致敏物质接触皮肤后，树突状细胞在移动到淋巴器官的过程中分化成熟，并上调一系列表面分子的表达。体外培养类树突状细胞：人组织细胞淋巴瘤细胞，并和受试物共暴露48h后，使用荧光抗体染料对细胞表面分子CD86染色并用流式细胞仪测定，从而评价受试物是否具有致敏性。5试剂5.1细胞选用人组织细胞淋巴瘤细胞（Thehumanhistiocyticlymphomacellline，U937细胞）。细胞使用前应进行稳定性检测。推荐使用cloneCRL1593.2细胞株。5.2培养基RPMI1640基础培养液中加入10%胎牛血清、适量抗生素，配制成1640完全培养基。5.3染色缓冲液磷酸盐缓冲液中加入5%的胎牛血清。5.4染料和抗体类物质7-氨基放线素菌-D染料（7-AAD）或碘化丙啶（propidiumiodide,PI）FITC标记的小鼠单克隆CD86抗体（FITC-CD86）FITC标记的小鼠IgG1（FITC-IgG1）6试验方法6.1细胞准备6.1.1细胞培养U937悬浮细胞使用1640完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养，倒置显微镜下观察细胞状态。细胞复苏一周并通过稳定性检测后可开展试验。细胞最大培养浓度不超过2×106个/mL，复苏后使用不超过6周，传代次数不超过21代。6.1.2细胞稳定性检测细胞复苏两周后，选用松香酸（AA）或2,4,6-三硝基苯磺酸作为阳性对照，乳酸（LA）作为阴性对照。当细胞可以准确对阳性物质和阴性物质进行稳定区分时视为通过稳定性检测。6.2受试物处理溶剂：完全培养基（优先选择）或二甲基亚砜（DMSO）受试物储备液：第一次运行至少选择6个浓度。于试验前一天制备，应用1640完全培养基配制0.4mg/mL的受试物溶液，或者应用DMSO配制50mg/mL的受试物溶液。由于没有进行剂量测定，因此在第一次运行时，应在相应的溶剂中配制6种系列浓度储备液（最终浓度为1、10、20、50、100和200µg/mL）。受试物工作液：于试验当天制备，用完全培养基配制的受试物溶液可以直接使用，用DMSO配制的受试物溶液需用完全培养基稀释125倍得到工作溶液。将工作液等体积加入细胞悬液中进行染毒，即最终细胞接触浓度是工作液浓度再稀释2倍。连续运行的浓度选择：基于第一次运行的结果选择至少4个第二次运行的浓度，任何后续运行的浓度都是基于之前所有运行的单个结果来选择。由于浓度间隔设置较小会影响浓度效应，所以建议以下推荐使用的最终浓度(单位：µg/mL)进行试验：1、2、3、4、5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200。如果以上浓度无法测得受试物的70%细胞存活率浓度值（70%cellviability，CV70），可以进行浓度调整。但受试物最终细胞接触浓度最高不超过200µg/mL；如果CD86的阳性值在1μg/mL，则对0.1μg/mL进行评估，以确认不会导致CD86超过阳性阈值的受试物的浓度；DMSO最终接触浓度不得超过0.4%。选择标准：至少2个浓度与前一次试验相同；确认非细胞毒性下的最高CD86阴性浓度;确认所有非细胞毒性CD86阳性浓度；确认最低细胞毒性浓度；在EC150(或最高阴性非细胞毒性浓度)和CV70（或溶解度评估允许的最高浓度）之间均匀选择其他所需浓度；若前两次运行有差异，尽可能选择多的共同浓度；若存在干扰，需重新选择阳性浓度。6.3对照物处理培养基对照、溶剂对照（与受试物同法稀释）、阳性对照松香酸（DMSO溶解，最终浓度50µg/mL）、阴性对照LA（完全培养基溶解，最终浓度200µg/mL），每种对照需要准备三对复孔。6.4细胞铺板及染毒以3x105个/mL细胞传代培养2天或以1.5x105个/mL传代培养3天后，调整细胞浓度为5×105个/mL，取100µL/孔受试物工作液和100µL/孔细胞悬液1:1混合接种于96孔无菌平板中，每种条件下一对复孔，一孔用于CD86染色，一孔用于IgG1同型对照染色。每次CD86表达检测均需设置培养基对照、溶剂对照、阳性对照、阴性对照各三对复孔（当使用培养基作为溶剂时，溶剂对照与培养基相同），用密封带盖住板，在37±2°C，5±1%CO2，≥95%湿度下培养孵育45h±3h。6.5CD86表达检测孵育结束后，检查并确定溶解度（若在显微镜下观察到晶体或液滴，则会产生干扰）。用排枪将细胞吹两下从96孔平板对应移至V型板中，离心弃上清；用100µL冰冷染色缓冲液清洗一次，然后在100µL染色缓冲液中重悬细胞；用7-AAD染色细胞（5µL/孔，10min室温，避光）；用100µL冰冷染色缓冲液清洗一次，然后在100µL染色缓冲液中重新悬浮细胞；用FITC标记的抗CD86或小鼠IgG1（5µL/孔，30min，4°C，避光）染色细胞；用100µL冰冷染色缓冲液清洗两次；用100µL冰冷PBS清洗一次；在冰冷PBS中再悬浮细胞（96孔板中100µL或流式管中200µL）。注意：整个染色操作应在冰上进行，在每一个洗涤步骤中，不要通过反复的移液来重悬细胞，而是在弃去上清液后通过短暂的涡旋来分散细胞即可。用流式细胞仪对每组细胞的细胞存活率及CD86阳性细胞百分比进行测定。分别用以下用公式计算出受试物的细胞存活率（CV70）和受试物的细胞刺激指数（S.I.）。CV70=C1+V1：大于70%最小细胞活性值V2：小于70%最大细胞活性值C1（μg/mL）：V1对应的受试物浓度C2（μg/mL）：V2对应的受试物浓度S.I.=CD86+%：CD86阳性细胞百分比6.6流式细胞仪检测绘制SSC/FSC散点图，调节仪器电压，圈出U937细胞群P1门；绘制7-AAD直方图，圈出活细胞P2门；绘制FITC/SSC散点图，放置十字门，分析细胞表面标记物CD86的表达。通过获取完全培养基/IgG1孔表达值，设置FITC/SSC十字门分析标记，以便在可能的情况下，所有三个或至少两个完全培养基对照的IgG1位于0.6至0.9%区域内；如果这无法实现，则设置分析标记，使一个完全培养基对照的IgG1在0.6至0.9%，另一个完全培养基对照的IgG1在0.9%至1.5%；如果这仍然无法实现，则IgG1数据分布太广，必须放弃运行。之后在不移动分析标记的情况下，测量每个孔中IgG1阳性细胞或CD86阳性细胞的百分比。细胞显示在大小(FSC)和粒度(SSC)的散点图中，设置为对数比例（Log），以便清楚地识别第一门R1门中的（population）细胞群和消除碎片。设置流式细胞仪，每孔获得P1门细胞10000个或包括死亡细胞在内的多达20,000个细胞，或在分析开始后1min内获取数据。7结果评价7.1试验成立条件7.1.1完全培养基对照细胞平均存活率>90%；至少两个完全培养基对照的IgG1≥0.6且<1.5%；若丢弃一个完全培养基对照的离群值后，剩下的两个完全培养基对照的校正后的CD86表达值应高于或低于其平均值的25%；完全培养基对照校正后的CD86基础表达值≥2%且≤25%。7.1.2DMSO溶剂对照的平均存活率>90%；若丢弃一个DMSO对照的异常值后，剩下的两个DMSO对照的校正后的CD86表达值应高于或低于其平均值的25%；丢弃异常值后，DMSO溶剂对照CD86S.I.的平均值小于250%。7.1.3阳性对照三对复孔中至少两个为阳性（CD86S.I.≥150），必要时配制阳性对照系列浓度，应存在剂量反应。7.1.4阴性对照三对复孔中至少有两个为阴性（CD86S.I.<150%），且细胞活性≥70%。7.1.5溶解度干扰：受试物处理后45±3h(细胞染色前)在显微镜下观察到晶体或滴状，则提示测试受到受试物溶解度干扰。7.1.6颜色干扰：受试物FITC标记IgG1散点图如发生位置偏移，则提示测试受到受试物颜色干扰（IgG1荧光通道几何平均数S.I.≥150%）。7.2致敏性结果判定每种受试物至少进行两次独立的CD86表达检测试验。每种受试物表达检测试验，如果CD86S.I.仅在最高非细胞毒性浓度下高于150%，则在第一次试验中无法判定。每次表达检测试验，如果CD86S.I.在所有非细胞毒性浓度下低于150%，且无干扰（溶解度、颜色、细胞毒性），则该次CD86表达判定为阴性；如果CD86S.I.高于150%，不论有无剂量反应和/或干扰，则该次CD86表达均判定为阳性。如果两次试验CD86表达结果一致，则可判定该受试物是否具有致敏性；如果两次试验CD86表达不具有一致性，则需进行第三次试验。如果第一次试验无法判定，第二次与第三次结果不一致，则需进行第四次试验。最终的预测将基于三次或四次单独运行的结果来综合判定。7.3有效作用浓度计算对于判定具有致敏性的物质，进一步计算其有效作用浓度值（EffectiveConcentration，EC），选用以下公式计算CD86的有效作用浓度值（EC150）。EC150=C1+S.I.1:S.I.<150（EC150）最低刺激指数值S.I.2:S.I.≥150（EC150）最低刺激指数值C1（μg/mL）:S.I.1对应的受试物浓度C2（μg/mL）:S.I.2对应的受试物浓度8结果解释本试验结果能预测受试物的致敏性，可作为皮肤致敏性整合测试和评估方法（IATA）中的检测方法之一，这些结果在有限的范围内外推到人类。附件7皮肤吸收体内试验方法SkinAbsorption:inVivoMethod1范围本方法规定了化妆品原料皮肤吸收体内试验方法的术语和定义、试验原则、试验方法、试验数据和报告。本方法适用于化妆品原料经皮吸收的体内试验。本试验方法适用于单一成分的化妆品原料，非单一成分的原料若使用本方法进行评价，需要提供更多的科学依据说明其可行性。2试验目的本方法阐述了化妆品原料经皮吸收的体内试验方法，以便为化妆品原料的毒性分类、标签标识和应用提供试验依据。3定义3.1未吸收剂量unabsorbeddose染毒后，从皮肤表面洗脱下来的和附着在遮盖装置上受试物的量，还包括在染毒过程中从皮肤表面挥发的量。3.2吸收剂量（体内）absorbeddose（invivo）去除受试部位皮肤的受试物后，包括在尿液、笼具冲洗液、粪便、呼出气体（若有测试）、血液、各种组织（若有采集）以及保留在尸体中受试物的量。3.3可吸收剂量absorbabledose皮肤冲洗后，存留在皮肤表面或皮肤组织内受试物的量。4试验的基本原则受试物（最好用放射性同位素标记）施用于动物去毛的皮肤上，试验设定具有代表性的一个或多个剂量组。在预定的染毒时间内，采用适宜的（非封闭、半封闭式或封闭式）遮盖装置覆盖染毒部位以防止动物舔舐试验样品，并让受试制备物与动物皮肤持续接触染毒一段时间。在染毒结束时，去除遮盖装置并用适宜的清洁剂清洗动物皮肤，保留用过的遮盖装置和清洗液以备分析测定，并换上新的遮盖装置。在染毒前、染毒期间和染毒结束后，试验动物均需在单独的代谢笼中饲养，并收集其排泄物和呼出气体以备分析测定。如果有充足的证据表明极少产生或不产生挥发性的放射性代谢产物，则可以不收集动物呼出气体。通常，每个剂量组内设几个动物试验组，一组在染毒结束后立即处死，其他组依次在预定时间间隔点处死。每一个采样时间点处死的试验动物，对采集血样以及受试部位皮肤进行分析，并分析动物尸体以确定未被排泄的受试物的量。采集的样品以适当的方法进行分析，并对受试物经皮吸收的程度进行评估。5试验方法5.1受试物受试物是指被用于研究其渗透特性的物质。受试物最好用放射性同位素标记。制备的受试物（包括纯品、稀释品或者直接施用于皮肤的包含受试物的制备物）应与人体或者其他潜在目标种属可能的暴露形态一致（或是理想的替代物）；制备过程中出现任何不同于实际使用情形的改变必须有充分的理由。必要时，受试物可溶解或者悬浮于适当的溶媒中，对于非水性溶媒，应了解其吸收特性以及与受试物的潜在相互作用。5.2实验动物和饲养环境5.2.1动物物种、品系的选择大鼠是最常用种属，但也可使用皮肤吸收速率与人类更相似的无毛系列动物品系。一般选用年轻成年健康的单性别动物（通常用雄性）。试验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的±20%。如雄性大鼠的适宜体重为200g~250g，在该体重范围的上半区内更好。5.2.2性别和数量通常，由单一性别的至少4只动物组成一个试验组，每个测试样品的每个预定观察终点需设一组。试验中的每个预定时间点处死一组动物，比如在染毒结束时间点（通常是6h或24h）和后续观察期结束时间点（例如48h和72h）。若已有资料表明受试物的经皮毒性存在明显的性别差异，则应选用更敏感的性别，否则可任选一种。5.2.3饲养环境实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，饮水不限制。试验期间（最好也包括试验之前的适应期）动物应在代谢笼中单笼饲养，尽量避免食物和水溢出容器影响试验结果。5.3试验步骤5.3.1试验动物的准备试验开始前，每只动物应做好标记加以区别，并在各自的笼具中至少饲养5天以适应实验环境。然后，在染毒前约24h，将每只动物肩部和背部局部皮肤去毛，并用丙酮轻轻擦拭皮肤表面以去除皮脂，因肥皂残留物有可能促进皮肤对测试物的吸收，故不推荐用肥皂水清洗皮肤。剃毛面积应足够大，以确保能可靠地计算出每平方厘米皮肤对受试物的吸收量，剃毛皮肤面积应该至少为10cm2，该面积对于体重在200g~250g范围内的大鼠是适宜的。动物准备完成后，重新放回代谢笼。5.3.2皮肤染毒在皮肤表面确定特定面积的受试部位，将已知量的受试制备物均匀地涂抹于该部位。用量通常应采用人体可能的接触量，固体受试物通常为1~5mg/cm2，液体受试物最多可达10μL/cm2。可根据受试物预期的使用情况、研究目的以及物理性质调整染毒剂量，但应有适当理由。染毒后，受试部位应避免被触碰。通常，受试部位应采用非闭合的遮盖装置覆盖（如透气尼龙纱布罩），典型装置的示例如图1所示。某些特定情况下，受试部位应采取闭合性保护。若半挥发性测试物质的挥发导致受试物的回收率超出可接受的范围（另见5.4），应在受试物装置上覆盖活性炭过滤器以捕获挥发的受试物（见图1）。任何覆盖装置都不应损伤皮肤，也不能吸收或与受试制备物发生反应。染毒后，将动物放回单独的代谢笼中以便收集排泄物。图1一种用于覆盖和保护受试部位皮肤的典型遮盖装置设计示例图5.3.3染毒时间和取样染毒期是指在皮肤开始接触受试物，至清洗去除受试物之间的时间间隔。所采用的染毒时间（一般为6h或24h）应与通常人体可能的接触时间相对应。染毒结束后，将动物饲养于代谢笼中保留直至预定的处死时间点。染毒结束后，应对受试皮肤进行观察并记录任何可见的刺激症状。在整个研究过程中，应采用代谢笼分别收集尿液和粪便，并可在14C-标记的二氧化碳和挥发性14C化合物（>5%）产生时进行收集和定量分析。尿液、粪便和捕获液（如14C标记的二氧化碳和挥发性14C化合物）应在每个取样时间点从每组中单独收集。若有足够的资料证明很少或几乎不产生放射性代谢物，则可采用开放式笼架。整个试验期间，应定期观察动物的毒性或异常反应。染毒期，从开始皮肤接触后至24h以及随后的每一天，均应收集排泄物直至试验结束。一般而言，采集三个时间点的排泄物通常就足够了，但某些受试制备物的特征或现有动力学数据可能会要求有更适宜、或更多的收集时间点以便研究。染毒结束时，从每只动物身上移去保护装置并单独保留以便试验分