陈骨和烧骨DNA提取的法医学鉴定探讨

1.北京汇正卓越科技有限公司司法鉴定中心，北京102488；2.齐齐哈尔市公安局刑事技术支队，黑龙江齐齐哈尔161000；3.北京中一诺达科技有限公司司法鉴定中心，北京100015；4.北京华大方瑞鉴定技术有限公司司法鉴定中心，北京101300；5.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古包头014040骨是由骨组织、骨膜和骨髓等构成的坚硬器官，在机体中主要起支持、运动和保护作用，骨中含有大量钙、磷等矿物质。骨组织是骨骼的主体结构，包括骨组织细胞和骨基质。骨基质是指钙化的细胞外基质，包括有机成分和无机成分。骨组织细胞包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞，细胞间质主要是由胶原和羟基磷灰石构成。骨中30%是由骨细胞分泌的胶原，65%～75%则是骨骼的支撑结构羟基灰石。骨组织中骨细胞、成骨细胞和破骨细胞是骨骼DNA的主要来源。由于骨骼组织坚硬，具有良好的抗腐败、侵蚀、灼烧等功能，是生物个体组织中降解缓慢、抗污染力强的结构，能够较好保护生物个体的DNA，即使其他软组织被完全腐败、碳化，在骨骼组织中仍可提取DNA检材。提供骨骼中DNA并进行生物信息检测和比对研究，在当今考古、法庭科学领域中是一项重要的技术手段。在软组织不具有提取DNA价值时，可以考虑在骨中提取DNA。法庭科学鉴定工作中，除了在腐败尸体中提取骨DNA，还包括在陈骨和烧骨中提取DNA。然而同样由于骨骼抗腐败、侵蚀的原因，相较于其他组织，骨骼的酶解消化、DNA提取和纯化难度也随之增大。笔者通过在法医物证学领域的工作和学习，分享了关于陈骨和烧骨DNA的提取、测序要点等检验鉴定内容，以期为广大鉴定同仁、法律界人士提供参考。一、陈骨与烧骨（一）陈骨对于陈骨的定义，目前尚无权威的解释，主要是指年代久远的骨骼，包括掩埋多年的尸体、古代尸体、木乃伊，甚至骨化石等。对于古代尸体等陈骨的研究，主要是考古界等为了进行种群溯源或族属分类，如万诚等人［1］通过对陈骨的DNA提取和测序，获取了大量古人的遗传信息，这些DNA信息为骨样所属时代和与之有关族属的迁徙和发展，提供了丰富的研究资料。法庭科学鉴定工作中，对陈骨DNA的研究主要是为了进行个体识别。由于案发时间距离发现尸体的时间较远，尸体因环境因素腐败、白骨化，甚至骨骼被侵蚀、风化，难以辨识陈骨的个体信息，给案件侦破活动带来困难。通过对陈骨中DNA的提取和检验，可以进行个体识别。当然，也可通过对陈骨中DNA的提取和检验，进行亲缘关系鉴定，李成涛等人［2］曾报道了一起陈骨且骨骼已风化的案件，通过对陈骨与案件中可疑父母进行亲缘关系鉴定，虽然检出的基因位点较少，但仍推断出了骨样本身源者的性别，并推断不排除骨样与疑母存在亲缘关系，为侦查提供了方向。（二）烧骨在法庭科学鉴定工作中，烧骨通常是指人体中骨骼与其他组织在火灾、爆炸、焚尸等案件中，被焚烧后，残留的烧焦尸骨或残骨碎片。骨骼加热到300℃以上时，开始因为灼烧而出现长轴方向裂隙，随着温度的升高，骨骼内的有机物变性、丧失，骨骼的颜色开始由黄色向褐色、深褐色、黑色、灰白色、白色依次逐渐变化，骨骼的脆性也随之增加。烧骨可以导致有机物变性、碳化，焚烧严重者可使有机物丢失、灰化，骨组织的DNA检出率也随骨骼的被焚烧程度变化，焚烧程度越高的，骨DNA的检出率也随之降低。二、骨中DNA的提取对骨DNA的提取，无论何种方法都应当避免污染，实验室在收到骨检材后，应按实验室工作管理要求进行必要的登记和妥善保存。骨DNA提取前，首先应将骨样洗净晾干，而后进行紫外线照射，再以锯、钻、刮等方式取得骨屑或骨粉。与其他组织DNA的提取一样，骨DNA的提取同样遵循三个步骤，即第一，对材料进行细胞裂解，使其释放DNA分子；第二，细胞裂解后，将DNA分子与其他细胞物质分离；第三，将DNA提纯，并制备成可以进行聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）扩增等应用形式的样本。提取过程应防止样本之间、样本与外源物质之间的污染。目前较为成熟的骨DNA提取方法有：苯酚-氯仿法、Chelex-100法、硅珠法、硅胶膜法等，对于烧骨更加微量DNA的提取，国内学者还提出了改良苯酚-氯仿法、十六烷基三甲基溴化胺法［3］等。（一）苯酚-氯仿提取法苯酚-氯仿法是经典的DNA提取方法，广泛用于DNA测序工作中。在骨DNA提取时，采取碎骨、研磨方法取骨样，通过乙二胺四乙酸钠（EthyleneDiamineTetraaceticAcid，简称EDTA）脱钙、十二烷基硫酸钠（SodiumDodecylSulfate，简称SDS）去污、蛋白酶K（ProteinaseK，简称PK）消化，再通过离心分离DNA方式获得样液，而后使用苯酚（phenol）和氯仿（Trichloromethane，也称三氯甲烷）进行萃取，最后获得DNA。在此过程中，使用EDTA可以螯合钙、镁等金属离子，极大减少组织被破坏，不影响DNA分子结构。（二）Chelex-100提取法Chelex-100是一种由苯乙烯和二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，内部含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，具有非常明显的螯合多价金属离子作用。通过螯合镁离子等，使核酸酶失去活性，保护DNA分子不被降解。在骨DNA提取时，与苯酚-氯仿提取法取得样液过程相同，再通过Chelex-100提取DNA。提取过程中应始终在一个试管内进行，可有效避免污染。但由于本法提取的DNA纯度不高，所以笔者不建议运用Chelex-100法提取骨DNA。（三）硅珠提取法异硫氰酸胍（Guanidiniumthiocyanate，简称GuSCN）具有裂解消化细胞且抑制核酸酶活性的作用，硅珠法是通过碎骨、研磨、EDTA脱钙、PK+GuSCN裂解消化骨中DNA，并利用硅珠在裂解介质中对DNA的特异性吸附作用，将骨DNA进行提取。刘雅诚［4］等人研究认为，硅珠法相较于Chelex-100或苯酚-氯仿法，可以明显提高骨DNA的检出率。GuSCN属于有毒物质，特别是其在遇酸后可产生有毒气体氰化氢（HCN），提取时应注意人员和环境的保护。（四）硅胶膜提取法硅胶膜法是通过挫骨、EDTA脱钙、消解获取含有骨DNA的样液，再通过快速离心柱，将DNA结合到QIAamp硅胶膜上，并过滤掉其他污染物，再通过两次洗涤，将二价阳离子和蛋白质等去除，最高得到高纯度的DNA。在取骨样时，可以挫取骨粉的方法获取，无需对骨样进行研磨，减少提取流程，是笔者比较推荐使用的方法。［5］（五）改良苯酚-氯仿提取法徐国昌等人［6］通过对苯酚-氯仿法进行改良，并运用改良后方法进行实验，研究后认为，改良方法虽然比常规方法多了3个步骤，且实验时间也较常规方法耗时长，但DNA的产率明显提高，是烧骨DNA提取工作中值得推广的方法，可以有效维护DNA分子结构。在DNA提取时，使用EDTA可以极大减少组织破坏，不影响DNA分子结构；在氯仿、异戊醇的作用下，减少酚对DNA分子结构的破坏。对于DNA样品纯度不好的，应当进行纯化处理，PCR反应物应当尽快进行电泳且体积在10ul为宜。当出现“影子带”（StutterBand，又称鬼影带），读取时应当进行严格鉴别。（六）十六烷基三甲基溴化铵提取法十六烷基三甲基溴化铵（SixteenAlkylThreeMethylBromide，CTAB）是一种阳离子去污剂，能溶解细胞膜，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，可以用于从大量产生黏多糖的有机体中制备纯化DNA。叶健等人［3］通过实验，将烧骨研磨后加入CTAB缓冲液中，室温下放置12～24h，而后加入PK，经过水浴震荡等流程使骨组织细胞释放DNA，再通过离心获取含有DNA的液体。通过磁珠纯化DNA、PCR扩增后，焚烧度较轻烧骨可以检验完整清晰的DNA图谱，焚烧度越重DNA的缺失位点越多。相较于传统苯酚—氯仿提取法，CTAB法提取陈旧骨和烧骨的DNA更加稳定、简便。（七）其他其他还有一些新型的骨DNA提取方法，如美国的Steadman等人［7］研究的，利用热离析作用协同PCR技术对烧骨DNA的提取，其实验中使用了十种化学药品，结果表明每一种处理方法都可以顺利获取DNA。三、结语法庭科学从业人员或司法鉴定人，在受理此类案件时，应对送检骨样进行初步审查，对陈骨的腐败、降解程度和烧骨的烧灼程度进行肉眼综合判断，经初步审查认为难以检出或仅可部分检出DNA序列的检材，受理审查人员应在检验前向委托方进行告知。陈骨和烧骨的检出率主要依靠取材和骨DNA提取过程，除了上述注意要点外，实验时还应注意防止样品污染。如，在吸加PCR试剂和模板时，吸样要慢且尽量一次性完成，避免因多次抽吸导致的交叉污染或气溶胶污染。取材料、碎骨、研磨、DNA提取等每一次操作过程要勤换手套，特别是进入不同区域、接触不同物体都要更换手套。每一项操