SN2563-2010肉及肉制品中常见致病菌检测MPCR-DIHPLC法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准肉及肉制品中常见致病菌检测MPCR-DHPLC2010-05-27发布国家质量监督检验检疫总局本标准按照GB/T1.1---2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、北京盈九思科技发展有限公司。1SN/T2563--2010肉及肉制品中常见致病菌检测MIPSR-IDHHPLC法1范围本标准规定了肉及肉制品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、溶血链球菌6种常见致病菌的MPCR-DHPLC检测方法。本标准适用于肉及肉制品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、溶血链球菌6种常见致病菌的快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.4食品卫生微生物检验沙门氏菌检验GB/T4789.8食品卫生微生物检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GB/T4789.9食品卫生微生物检验空肠弯曲菌检验GB/T4789.10食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌检验GB/T4789.11食品卫生微生物检验溶血性链球菌检验GB/T4789.30食品卫生微生物检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验SN/T0184.1进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应。MPCRmultiplexPCR多重PCR。DHPI.Cdenaturinghighperformancefiquidchromatography变性高效液相色谱。TEAA三乙基铵乙酸盐。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489的有关规定执行。5废弃物处理和防止污染的措施5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施按GBT27103规定执行。6原理多重PCR,又称多重引物PCR或复合PCR.它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液(TEAA),核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。7试剂和材料除另有规定外，所有试剂纯度应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。7.1TaqDNA聚合酶。7.7蛋白酶K(20mg/mL)。7.8氯化钠溶液(NaCl):5mol/L和0.7mol/L。7.10三氯甲烷。7.11异戊醇。7.13异丙醇。7.1470%乙醇。7.15DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50mLTEAA和250μl.乙腈混合，加水定容至1000mL;缓冲溶液B为50mLTEAA和250ml,乙腈混合，加水定容至1000mL;缓冲溶液D为75%乙腈。8主要仪器和设备238.3高速离心机：离心转速18000g。8.4PCR超净工作台。8.6灭菌PCR反应管。9方法提要与检测程序9.1方法提要本方法应用六重PCR同时扩增肉及肉制品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、溶血链球菌6种致病菌。六重PCR产物再利用DHPLC非变性条件下的DNA分离技术，根据DNA扩增片段长度的不同，按照从小到大顺序依次洗脱核苷酸片段，从而实现对肉及肉制品中6种致病菌进行快速检测。9.2检测程序变性高效液相色谱法检测肉及肉制品中常见致病菌检测流程见图1。样品制备增菌肉汤细菌DNA的提取多重PCR扩增可疑阳性结果结果根告图1变性高效液相色谱法检测肉及肉制品中致病菌流程图410操作步骤10.1样品制备、增菌培养和分离10.1.1沙门氏菌检验样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB/T4789.4方法进行。10.1.2小肠结肠炎耶尔森氏菌检验样品的制备，增菌培养和分离步骤参照GB/T4789.8方法进行。10.1.3空肠弯曲菌检验样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB/T4789.9方法进行。10.1.4金黄色葡萄球菌检验样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB/T4789.10方法进行。10.1.5溶血性链球菌检验样品的制备、增菌庠养和分离步骤参照GB/T4789.11方法进行。10.1.6单核细胞增生李斯特氏菌检验样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB/T4789.30或SN/T0184.1方法进行。10.2增菌液模板DNA的制备取10.1中的各致病菌的培养物1.5m,加到1.5mL无菌离心管中，13000g离心1min;吸弃上清液，取沉淀，加567μL.TE溶液(pH8.0),悬浮，加30μL10%SDS和3μl蛋白酶K(20mg/mL),混匀，37℃温浴1h;加100μL.氯化钠(5mol/L).混匀，加80μLCTAB/NaCl溶液(10%CTAB和0.7mol/L氯化钠),混匀，65℃温浴10min;加等体积三氯甲烷/异戊醇(体积比为24:1),混匀，13000g离心10min;取上清液，加等体积酚/三氯甲烷/异戊醇(体积比为25:24:1),混匀，13000g离心10min;取上清液，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，13000g离心10min;取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加100μL.TE溶液(pH8.0)溶解·此即为DNA溶液。若不能立即检测，可保存于-20℃备用。按同样方法制备阳性对照菌株和阴性对照菌株的增菌液模板DNA。也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA。10.3DNA浓度和纯度的测定取5μl.DNA溶液加水梯度稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照式(1)计算：c=A×N×50/1000………(1)式中：A--260nm处的吸光值；N--核酸稀释倍数。10.4PCR扩增10.4.1PCR反应体系(50μL):10×PCR缓冲液5μL、dVTPs终浓度0.3mmol/L、Taq酶1.5U、模板DNA(20ng/μL)5μL、单核细胞增生李斯特氏菌·小肠结肠炎耶尔森氏菌：空肠弯曲菌：溶血性链球菌：金黄色葡萄球菌：沙门氏菌各引物对(6.?μmolL)终浓度比例为1:1:1.2:0.9:1:1.1,水补足至50μL。10.4.2反应条件：95℃预变性5min:95℃变性10m60℃退火20s,72℃延伸60s,进行38个循环；72℃延伸7min,4℃保存反应产物。10.4.3将PCR产物进行DHPLC分析。510.5.1DRPLC分析条件10.5.1.1色谱柱：PS-DVB&.CDNASep色谱柱(4.6mm×50mm,粒度3μm)。10.5.1.3流动相(体积比)。-0.0min,55.0%缓冲溶液A,45.0%缓冲溶液B;-0.5min,50.2%缓冲溶液A,49.8%玺冲溶液B;3.1min,42.6%缓冲溶液A,57.4%缓冲溶液B;5.8min,39.1%缓冲溶液A,60.9%缓冲溶液B;—8.4min,37.1%缓冲溶液A,62.9%缓冲溶液B;--11.0min,35.8%缓冲溶液A,64.2%缓冲溶液B。10.5.2DHPLC分析10.5.2.1将装有PCR产物的反应管放置在DHPLC金属板的微孔中。10.5.2.2登录DHPLC分析系统，按照10.5.1设置DHPLC分析条件，建立检测程序并运行。10.6质控对照设置检测过程中应分别设阳性对照和阴性对照。阳性对照为目标致病菌的标准菌株，阴性对照为大肠埃希氏菌等非日标致病菌的标准菌株。11结果及判断11.1.1阴性对照：无吸收峰出现。11.1.2阳性对照：出现典型的PCR产物吸收峰，且峰吸收值大于3mV。11.1.3不符合上述对照质控标准的视为无效。11.2结果判定和报告11.2.1检测样品无典型PCR产物阳性吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告末检出沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、溶血链球菌。11.2.2检测样品出现典型的PCR产物阳性吸收峰，出峰时间与各致病菌预期扩增片段大小的阳性对照相一致，且吸收峰值大于3mV时，可判定该样品结果为×××致病菌可疑阳性。11.2.3检测样品出现典型的PCR产物阳性吸收峰，但吸收峰值小于3mV时，建议样本重做。重做结果峰吸收值仍小于3mV则为×××致病菌阴性，否则为×××致病菌可疑阳性。11.2.4对于×××致病菌可疑阳性结果，应参见CB/T4789.30或SN/T0184.1、GB/T4789.4、GB/T4789.8、GB/T4789.9、GB/T4789,10、GS/T4789.11做进一步的生化鉴定和报告。(规范性附录)肉及肉制品中常见致病菌多重PCR-DHPLC检测所用引物序列表A.1肉及肉制品中常见致病菌多重PCR-DHPLC检测所用引物序列序号基因致病菌名称