SN 1460-2004输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法Detectingmethodsforwestnilev2004-11-17发布2005-04-01实施I本标准的附录A为资料性附录。1输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法本标准适用于检验检疫机构对输入性蚊类体内携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测和报告，下列术语和定义适用于本标准称型单股正链RNA病毒，约1000bp~11000bp.5生物安全要求下列操作必须在生物安全3级(BSI,3)实验室中进行： 用蚊胸腔接种的方法分离病毒 收集或浓缩病毒或其培养产物 可能产生含病毒气溶胶的样品处理： 离心管和离心机转头的封闭和开启，26.1.2试剂应符合GB/T6682中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提)时所用的水必须是无RNA酶6.1.2.4RNA抑制剂(RNasin)a)引物对1如下：——上游引物WNENV—forward:5'-TCAGCGATCTCTCCACCAAAG-3’b)引物对2如下：——上游引物WN233:5'-TTGTGTTGGCTCTCTTGGCc)引物对3如下：——上游引物WN3’NC—forward:5’-CAGACCACGCTACGGCG-3’;——下游引物WN3’NC—reverse:5’-CTAGGGCCGCGTGGG-3’。a)引物对1如下：b)引物对2如下：——下游引物SLE2131c:5'-GT310×10~3mol/LTris-HCl(pH8.0)、1×10-3mol/LEDTA(pH8.0)。Tris-HC150×10-3mol/L(pH8.3)、氯化钾(KCl)50×10-3mol/L、氯化镁(MgCl₂)Tris-HCl10×10~3mol/L(pH8.4)、氯化钾(KCl)50×10~3mol/L、氯化镁(MgCl₂)Tris54.0g、硼酸27.5g、EDTA2.9g,加水到1000mL,用5mol/L的盐酸(HCl)调到pH8.0。每100mL溶液中含溴酚蓝0.25g,蔗糖40g。将采集的蚊虫样本饲养2d以上，待胃内血液全部消化后将其冷冻致死。分类、分性别编号，按磨或置电动匀浆器中匀浆20s～30s,使样品匀浆成糊状。匀浆放入离心管中以14000r/min离心3min,取上清液140μL加入等体积的含异硫氰酸胍和碘菌蒸馏水1.5μL,再覆盖50μL矿物油。加人0.2mol/LEDTA终止反应，反应物用酚抽提，乙醇沉淀cDNA。加人PCR扩增缓冲液，dNTP各250×10-6mol/L、正向引物和反向引物各50×10-12mol/L～100×10-12mol/L,使反应体积4——分别取已胸内接种感染西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的实用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖(含0.5pg/mL溴化乙锭，EB)平板。将平板放入水平电泳DNA标准分子量作对照，推荐使用pUC19DNA/Msp(HpalI)。5V/cm电泳约0.5h,当溴酚蓝到达6.2.8结果判定6.2.8.1在紫外灯下观察核酸带并判断结果。6.2.8.2PCR后阳性对照会出现一条DNA片段带，阴性对照和空白对照没有该核酸带。DNA片段——引物对1检测出的病毒核酸带在70bp位置；——引物对2检测出的病毒核酸带在408bp位置：——引物对3检测出的病毒核酸带在103bp位置。——引物对1检测出的病毒核酸带在393bp位置；——引物对2检测出的病毒核酸带在495bp位置；6.2.8.3待测样品电泳后在相应bp数的DNA位置上有核酸6.2.8.4无核酸带或核酸带的大小不是相应bp数的为阴性。参见附录A。8.1逆转录聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测到西尼罗病毒或圣路易脑炎病毒特异性基因，报告为采用RT-PCR法或其他检测方法进行检测，出现阳性结果的相应标本应送指定的实验室做复检或5A.1.2器材制备每隔1.0mm划一刻度。用1个或2个圆形环，通过螺旋帽，将接种用注射针头与一金属柄密接。此金A.1.3.2.1包被抗体辣根过氧化物酶(HRP)标记的黄病毒群特异性抗体(MAb6B6C-1-HRP)碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g,碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g,加双蒸水至1000mL,pH9.6。氯化钠(NaCl)8g,磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g,磷酸氢二钠<Na₂HPO₄·12H₂O)2.9g,(KCl)0.2g,吐温-200.5mL,叠氮化钠(迭氮钠)0.2g,加双蒸水至1000mL,pH7.4,保存于4℃冰箱A.1.4.3封闭液PBS(内含1%去脂奶粉，0.1%吐温-20)。前以枸橼酸-磷酸盐缓冲液(pH5.4)稀释成0.1mg/mL,每毫升内加入0.75%双氧水(H₂O₂)4.2pL,此溶液应在1h内使用。2mol/L硫酸(H₂SO₄)b)在各孔内加入4HAU待鉴定的病毒血凝素50μL,混匀后37℃作用1h。c)然后加入1%GRBC50μL,置微型振荡器上混合1min,放湿盒内室温静置45min～60min后凡是能被最高稀释度的抗西尼罗病毒或抗圣路易脑炎病毒标准血清抑制其血凝反应者，即可确定 (MAbs3.91D为1:2000,MAb4A4C-4为1:4000)后包被酶标板，每孔中加100μL,4℃过夜或37℃孵育5h,倒出孔内液体。A.4.2.1.2洗涤A.4.2.1.3封闭A.4.2.1.4加入待测样品每个样品加两孔，每孔100μL。另将标准西尼罗病毒或圣路易脑炎病毒悬液(阳蚊虫匀浆(阴性对照)和PBS-T洗液(空白对照)也各加两孔。在加样前，待测蚊虫匀浆的上清液以PBS-吐温液(0.5%吐温-20)室温处理15min～30min(可降低本底或提高试验的敏感性)。4℃过夜或每孔加100μL0.1%的双氧水(H₂O₂)(应用双蒸水稀释),37℃反应15min,倒出孔内液体。用在每孔中加入100μL用PBS-T稀释(1:10000)的酶标记黄病毒群特异性抗体(MAb6B6C-1-每孔中加入100μL双氧水(H₂O₂)/3,3’,5,5